BioTechnicalフォーラム [人コラーゲン1のウエスタン]

人コラーゲン1のウエスタン

No.6207-TOPIC - 2017/08/13 (日) 11:15:02 - コラーゲン1

細胞外マトリックスのウエスタンはあまり良い経験がありません。
今、人線維芽細胞からコラーゲン1のウエスタンをできないか考えています。

サンプルはライセートおよび培養上清です。
コラーゲン1抗体はabcamのAnti-Collagen I ウサギポリクロ抗体 (ab34710)です。

細胞免疫染色は綺麗に染まってくれます。
ウエスタンはまだ検討していませんが、コラーゲン1は3量体を作るはずなので、酵素処理してバラすべきか、それともそのままウエスタンしてもいいのか（それで正しい結論を得られるのか）悩んでいます。

実際行えば済む話ですが、もしみなさまの中で行われた方、いらっしゃいましたら、方法をシェアしていただけますと幸甚です。宜しく御願い致します。
　

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No.6207-7 - 2017/08/18 (金) 23:47:20 - あ

抗体はヒト血清で、ヒトのコラーゲンではなく魚のコラーゲンを検出してます。使えそうな抗体の情報を持っていなくて申し訳ないです。

昨日のコメントですが、型が同じなので恐らくヒトも魚も同じだと思っています。違かったらごめんなさい。

加熱するとコラーゲン以外ほとんど沈殿するのですが、それでも良いのでしょうか？細胞をSDSサンプルバッファーにそのまま放り込んで加熱するのも手かもしれませんね。

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No.6207-6 - 2017/08/18 (金) 05:41:59 - コラーゲン1

あ様ありがとうございます。

ご経験のあられる方からのコメントをいただき、感謝しています。

酵素処理はやはりそういう問題が孕んでいるのですね。ありがとうございます、勉強になります。
あ様の抗体の情報を開示していただけませんでしょうか？またサンプルはヒトでしょうか？

私はアブカムのうさぎポリクロですが、もともとサンタクルズのポリクロを使っていてとても綺麗に使えていました。今は買うことができません。

加熱操作が必要というのは初めて聞きました。質問してよかったです。ありがとうございます。

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No.6207-5 - 2017/08/18 (金) 05:38:03 - コラーゲン1

mon様おそくなりすみません。
はい、それは存じあげていたのですが、論文での使用実績があり、その矛盾点につきトピックを立てました。免疫染色では、メタノール固定で綺麗にそまってくれます。あとは凍結にも綺麗に使えます。パラフィンはだめでした。

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No.6207-4 - 2017/08/17 (木) 23:38:38 - あ

普段から1型コラーゲンのウエスタンをしています。ホモジネートを加熱すると1本鎖または2本鎖になって可溶化します。10℃10分間くらい。加熱しないと可溶化しないので、検出できません。また、酵素処理は良からぬところで切れるのでオススメしません。

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No.6207-3 - 2017/08/13 (日) 15:29:52 - mon

抗体に関して、実施例としてHPの記載・論文報告を調べるのは基本ですよ。
これらが乏しいものや自作したモノは、試行錯誤が必要です。