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(無題) 削除/引用 No.6196-4 - 2017/08/10 (木) 17:58:32 - 7744 RAW264.7にレトロで6000bpほどの遺伝子を導入して安定発現させたことがあります。 発現はSDS-PAGEで確認しております。 MPさんの仰るように、レンチであればそれなりに入りますが、レトロだとなかなか入らないです。 プロトコールを示していただければ何かしらアドバイスできるかもしれません。 私が作製した時には、RAWだとかなり入りにくいとあらかじめ聞いていたので、以下の点を採用しました。 １、感染後にGFPでセレクションできるレトロのベクターを用いました。 （薬剤でも問題ないです） ２、万全を期すため、FCSを抜いた状態でplatEにトランスフェクションを行いました。 ３、パントロピックに感染させるためにVSV-Gの発現ベクターを共発現させました。（どこまで意味があるかわかりませんでしたが、コントロールとしてVSV-G無しでもやっていましたが、そちらでは感染無しか極めて低い効率でした。） ３、感染時にはポリブレンを加えました。 この程度です。 初めてRAWに感染させましたが、始めてやって一度で問題なく作製できました。 ただ、感染して導入が成功しても、発現するかどうかはまた別の話。。。 私の場合はFLAGをつけていたので、クローン化を行ってから１０〜２０クローンをSDS-PAGEで確認しました。 私も以前は線維芽細胞でやっていたので、こんなにも効率が違うものかと驚きました。 MEFでは90%以上感染していましたけど、おそらくRAWではどんなにうまくいっても0.1%もいかないでしょう。あるいは0.01%以下かも。。。 ですのでセレクションは必須ですね。

(無題) 削除/引用 No.6196-3 - 2017/08/09 (水) 10:35:56 - MP Ecotrophicのレトロでは難しいかも。Rawに関してはレンチなら問題なく安定株作製できました。もちろんある程度高タイタ−のウイルスは必要と思われます。

(無題) 削除/引用 No.6196-2 - 2017/08/09 (水) 09:50:59 - I These cells are basically immune cells. So the cells of interest may induce immune reaction to invading virus to eliminate. Probably it is quite difficult to do it.

マクロファージ系細胞にウイルス感染 削除/引用 No.6196-1 - 2017/08/09 (水) 09:45:55 - マクロファージ マクロファージ系培養細胞のRaw264.7 cellやJ774.1 cellにPLAT-E細胞由来のレトロウイルスを感染させ、安定発現株を樹立しようとしています。 しかし、コントロールとして使用しているマウス線維芽細胞にはよく感染するのに対し、RawやJ細胞では効率がよくありません。 どなたか、これらの細胞の安定発現株を構築されたご経験のある方はいらっしゃいますでしょうか。もし、いらっしゃいましたら、どのように構築されたのかご教示お願い申し上げます。

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