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fusionタンパク質の作成 トピック削除
No.6193-TOPIC - 2017/08/08 (火) 13:54:50 - fusion
あるタンパク質XのN末にGFPをfusionさせたタンパク質を発現するプラスミドを作成するとき、GFPの終始コドンによっていったんそこで転写がストップしてしまうことを防ぐには、やはりその終始コドンを省いて塩基配列を設計するとよいのでしょうか。
よろしくお願い致します。
　
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No.6193-8 - 2017/08/09 (水) 09:31:15 - mon
翻訳開始メカニズムを勉強すると良いです。
Cap依存性翻訳開始機構と、RNAウィルスなどに多いCap非依存性翻訳開始機構（IRES配列を利用する）があります。
ただしCap依存性翻訳開始機構にも例外があって、mRNAの5'にある短いORF(ATG-STOP）が無視されて、２番目の(本来の）ATGから翻訳が開始される遺伝子もそこそこ有ります。無視される理由は不明なものが多いですが、原因の一つはATG近傍がマスクされるmRNAの二次構造のようです。
なお、fusionが懸念しているように超微量ですが 内在のATGから翻訳されるペプチドもあり(ただしタンパクとして機能しているか不明）、分解されてMHCに提示され免疫系の自己非自己の認識に関与しているようです。

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No.6193-7 - 2017/08/09 (水) 01:25:03 - おお
C-TERMに蛋白を融合するときにそのATGを取るかとらないかは、蛋白にMが必要なのかという明らかな根拠がないなら、それはそれぞれの研究者の感覚などの判断によるものです。どちらにするべきというはっきりとした方法論上の束縛はないです。

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No.6193-6 - 2017/08/09 (水) 01:19:47 - おお
ATGがあればそこから開始されるわけでもないのは、いろいろな蛋白が最初のアミノ酸以外に他の部分にもATG（メチオニン）があるという現状を考えれば明らかでしょう。もちろん状況によっては途中からの開始が起こりうるでしょうけど。またなにか遺伝子の蛋白がコードされているM（ATG）から始まる配列をいきなりExpression Vectorに入れても蛋白ができないこともあります。

あとはご自身で掘り下げて見てください。

(無題) 削除/引用
No.6193-5 - 2017/08/09 (水) 01:13:36 - I
No. It needs IRES between.

>[Re:4] fusionさんは書きました :
> monさん
> ありがとうございます。
> ちなみにですが、遺伝子のＣ末にGFPを負荷する場合もATGはそのままにしておくのでしょうか？そうだとすれば、GFPだけが単独で転写され、細胞内を独り歩きしそうな気がするのですが、どうなのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.6193-4 - 2017/08/09 (水) 01:08:34 - fusion
monさん
ありがとうございます。
ちなみにですが、遺伝子のＣ末にGFPを負荷する場合もATGはそのままにしておくのでしょうか？そうだとすれば、GFPだけが単独で転写され、細胞内を独り歩きしそうな気がするのですが、どうなのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.6193-3 - 2017/08/08 (火) 16:34:10 - mon
>GFPの終始コドンによっていったんそこで転写がストップしてしまう
転写ではなく翻訳です。

当然ながらGFPの終始コドンは取り除きます。
タンパク質Xの開始コドンに関しては、通常残します（完全長Xタンパクにするため、大腸菌由来タンパクで大腸菌で発現させる場合は、取り除くこともある）。
分泌シグナルを含む細胞内局在化シグナルには注意してください。融合配列によって機能しなくなる可能性が有ります。

(無題) 削除/引用
No.6193-2 - 2017/08/08 (火) 14:04:46 - fusion
すみません、追加でもう一つお願いします。
タンパク質Xの開始コドンも省くべきでしょうか？
よろしくお願い致します。

fusionタンパク質の作成 削除/引用
No.6193-1 - 2017/08/08 (火) 13:54:50 - fusion
あるタンパク質XのN末にGFPをfusionさせたタンパク質を発現するプラスミドを作成するとき、GFPの終始コドンによっていったんそこで転写がストップしてしまうことを防ぐには、やはりその終始コドンを省いて塩基配列を設計するとよいのでしょうか。
よろしくお願い致します。
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