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(無題) 削除/引用 No.6186-11 - 2017/08/07 (月) 13:13:41 - おお 要するにチューブリンの重合が維持されるような条件で核を集めたとき、チューブリンが核周辺のなにかに結合していれば、重合したたくさんのチューブリン分子が数珠つなぎになって核と同じフラクションに来てしまうだろうし、本当に長い重合体は核にくっついてなくても、重くて核を回収する遠心で落ちてくるかもしれないと思ったのです。 チューブリンを細胞質の蛋白を分けれたか確認するのに使っているならば、もしかしたらGAPDHなどのほうがやりやすいかもしれませんん。

タンパクのフラクショネーション 削除/引用 No.6186-10 - 2017/08/07 (月) 10:00:28 - フラクショネーション おお様ありがとうございます。 >[Re:9] おおさんは書きました : > 手順は，�@NP-40抜きの低張液，�ANP-40入りの低張液（ピペッティング），�B氷上静置，�C遠心（上清cyto）， > > �DNP-40抜きの低張液 > �E遠心 > > �Fextraction buffer，8 vortex，9 遠心(上清nuc)ということでよろしいでしょうか。 > > 一度洗うといいかと思います。 わかりました。 一度やってみます。 それと，チューブリンの重合について質問です。 重合それ自体の現象については把握しております。 実験をする上でそれが結果にどう反映されるのかを考えたのですがよくわかりません。 ご教授いただけると幸いです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.6186-9 - 2017/08/07 (月) 03:17:41 - おお 手順は，�@NP-40抜きの低張液，�ANP-40入りの低張液（ピペッティング），�B氷上静置，�C遠心（上清cyto）， �DNP-40抜きの低張液 �E遠心 �Fextraction buffer，8 vortex，9 遠心(上清nuc)ということでよろしいでしょうか。 一度洗うといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.6186-8 - 2017/08/06 (日) 01:17:16 - おお >lamin a/cでWBしてみたところ，細胞質では検出されませんでした。 lamin a/cは核マトリクスですから高いデタージェントでも耐性です。比較的クロマチンやその他構造体に弱い相互作用を持ったものは１％NP-40などを含むLysis bufferで溶出して検出している報告を結構見てきました。 そのキットにおいて０．６％は大丈夫なようにデザインされているでしょうけど、個人的には濃度を上げるよりは、０．６％で一度核を回収して、NP-40フリーの同じバッファーか低張液で洗うほうがいいんじゃないかなと思います。 あとTubulinの重合でグリセロールが使われるようで、入ってないほうがいいのかなぁと漠然と思います。 それかきっとの方法に頼らず他の方法を試してみてもいいのではないかと思います。この手の方法は随分前からやられていますので。 http://www.med.uio.no/imb/english/research/groups/chromatin-regulation-stem-cells/documents/isolation-somatic-cell-nuclei.pdf http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n3/full/nprot.2013.011.html （こちらの方法トリプシンを使っていますが、多分そのさじ加減はむずかしく必要ないようにおもいます。）

(無題) 削除/引用 No.6186-7 - 2017/08/05 (土) 22:29:13 - ２４５６７８９０ 特別なkitなど使わなくても1.0~0.5mMくらいのMgCl2と0.5% Triton X100を含む等張bufferで細胞を溶かして800xgで5min遠心して、沈殿をもう一度同じ組成のLysis bufferに再けんだくして遠心すればそれなりに純度の高い核画分が得られます。 すくなくともTubulinに関しては核＞＞＞細胞質（正確にはpost nuclear fraction)になります。

タンパクのフラクショネーション 削除/引用 No.6186-6 - 2017/08/05 (土) 18:14:01 - フラクショネーション おお様ありがとうございます。いつもいろいろ参考にさせていただいております。 >[Re:4] おおさんは書きました : > お示しの方法を見てませんが、NP-40は０．１％ぐらいがよくあるプロトコールではないかと。ようするの細胞膜に穴を開けてサイトゾルの中身を放出させるために使います。細胞を１％NP-40で処理するだけで核にあるいろいろなものが溶出されますので、３％なんかとんでもないと個人的には思ってしまいます。 プロトコルでは0.6％，溶解が不十分な場合は濃度を上げる旨が記載されています。 そこで濃度を上げてやってみています。 lamin a/cでWBしてみたところ，細胞質では検出されませんでした。 溶出のLysis bufferがペレットに対して少なかったのでしょうか。 > できればPotter- Elehjem Grinderなどで細胞をきっちりと破砕したほうがきれいにフラクションが取れるような気がしています。DTTやEDTAが入った状態では多分チューブリンは脱重合していくのではと勝手に思っていますので、細胞を０．１％NP-40の低張液で処理して（できればPotter- Elehjem Grinderをつかい）、核を遠心で回収した後、NP-40抜きの低張液（DTTとEDTA入）で何回か洗うといいと勝手に思ってます。Potter- Elehjem Grinderがない、または使えないようなスケールならば、２００ｕLのチップで数回ゆっくりとピペッティングしてやるといいのではないかと思います。前後しますが、細胞を０．１％NP-40の低張液で処理する前に、細胞を０．１％NP-40抜きの低張液で洗ってやると、最初の懸濁液中の塩の持ち込みを最小限に留めることができるので、細胞が壊れやすくなると思います。 > DTTはbufferに入れて使っています。 ホモジナイザーが使えないので，シリンジがピペッティングで対応したいと考えています。 手順は，�@NP-40抜きの低張液，�ANP-40入りの低張液（ピペッティング），�B氷上静置，�C遠心（上清cyto），�Dextraction buffer，�Evortex，�F遠心(上清nuc)ということでよろしいでしょうか。

タンパクのフラクショネーション 削除/引用 No.6186-5 - 2017/08/05 (土) 18:02:25 - フラクショネーション コメントありがとうございます。 >[Re:3] ２４５６７８９０さんは書きました : > 核画分、細胞質画分に分画するといってもこれはあくまで相対的な話なので、正確には核成分主体の画分と細胞質成分が主体の画分と考えて下さい。なので非イオン性界面活性剤を使用しても核画分といっても核80~90 細胞質20~10くらいから成っていますからTubulinも少しは残ります（界面活性剤無しだとさらに純度は下がります）。その多くは核膜にくっついたままのtubulinとおもいます。western blottingしたとき、高感度の検出系だったり、アプライ量を多くすれば当然、それらはそれなりに検出されてきます。 > 細胞質と大差ないくらいの量のtubulinがが核にも検出されているのでしょうか？ 細胞質＞核でtubulinが検出されます。 > 方法上の問題として、細胞ペレットの体積に対してlysis bufferの液量が少ないと細胞の可溶化効率が低下して細胞自体のdisruptionが不完全になり結果としてsemiintactなcellが核画分に混入して純度が下がることはあるとおもいます。 > 確かに，ペレットの割に少しLysis bufferが少ない気もしてきました。 Lysisを増やすのと，氷上静置のところをローテーターとかにしてやってみようかなと考えているところです。

(無題) 削除/引用 No.6186-4 - 2017/08/05 (土) 17:16:42 - おお お示しの方法を見てませんが、NP-40は０．１％ぐらいがよくあるプロトコールではないかと。ようするの細胞膜に穴を開けてサイトゾルの中身を放出させるために使います。細胞を１％NP-40で処理するだけで核にあるいろいろなものが溶出されますので、３％なんかとんでもないと個人的には思ってしまいます。 できればPotter- Elehjem Grinderなどで細胞をきっちりと破砕したほうがきれいにフラクションが取れるような気がしています。DTTやEDTAが入った状態では多分チューブリンは脱重合していくのではと勝手に思っていますので、細胞を０．１％NP-40の低張液で処理して（できればPotter- Elehjem Grinderをつかい）、核を遠心で回収した後、NP-40抜きの低張液（DTTとEDTA入）で何回か洗うといいと勝手に思ってます。Potter- Elehjem Grinderがない、または使えないようなスケールならば、２００ｕLのチップで数回ゆっくりとピペッティングしてやるといいのではないかと思います。前後しますが、細胞を０．１％NP-40の低張液で処理する前に、細胞を０．１％NP-40抜きの低張液で洗ってやると、最初の懸濁液中の塩の持ち込みを最小限に留めることができるので、細胞が壊れやすくなると思います。

(無題) 削除/引用 No.6186-3 - 2017/08/05 (土) 15:56:27 - ２４５６７８９０ 核画分、細胞質画分に分画するといってもこれはあくまで相対的な話なので、正確には核成分主体の画分と細胞質成分が主体の画分と考えて下さい。なので非イオン性界面活性剤を使用しても核画分といっても核80~90 細胞質20~10くらいから成っていますからTubulinも少しは残ります（界面活性剤無しだとさらに純度は下がります）。その多くは核膜にくっついたままのtubulinとおもいます。western blottingしたとき、高感度の検出系だったり、アプライ量を多くすれば当然、それらはそれなりに検出されてきます。 細胞質と大差ないくらいの量のtubulinがが核にも検出されているのでしょうか？ 方法上の問題として、細胞ペレットの体積に対してlysis bufferの液量が少ないと細胞の可溶化効率が低下して細胞自体のdisruptionが不完全になり結果としてsemiintactなcellが核画分に混入して純度が下がることはあるとおもいます。

タンパクのフラクショネーション 削除/引用 No.6186-2 - 2017/08/05 (土) 15:24:35 - フラクショネーション 文字化けしてしまっていますが，CelLytic NuCLEAR Extraction Kitです

タンパクのフラクショネーション 削除/引用 No.6186-1 - 2017/08/05 (土) 15:23:00 - フラクショネーション いつもお世話になっております。 タンパク抽出において，核と細胞質を分けて実験を行うことになりました。 そこで，プロトコルを探していたところ，CelLytic™ NuCLEAR™ Extraction Kit(調べていただくと日本語プロトコルがPDFで手に入ります)が自前の試薬ででき，簡便だと思い，実施してみました。 手順としては，プロトコルAの「100ulの細胞ペレットからの界面活性剤を用いた核タンパク質の抽出法」で行っています。 細胞はHeLaです。 手順8番目のNP40濃度を0.6％のところを3％までふって検証してみました。 その結果，すべてのNP40濃度において核にチューブリンが残存していることがわかりました（WBより）。 細胞膜がよく溶解できていないことが原因と考えられますが，どのようにしたら良いでしょうか。 どうぞよろしくお願いします。

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