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追記 削除/引用 No.6167-2 - 2017/07/30 (日) 00:09:40 - コンブ 　溶出回数の記載を忘れてしまいました。 　溶出回数はバッチ法6回行い、最初の1-2回で溶出できる分はほぼ溶出している印象ですが、CBB染色で6回目までうっすらバンドが確認できます。次回は完全にバンドが確認できなくなるまで溶出を行おうかと思っております。

GSTの溶出効率 削除/引用 No.6167-1 - 2017/07/29 (土) 22:44:03 - コンブ 　いつもお世話になっております。いつも過去トピックを拝見させて頂いております。 　ヒトの膜タンパク質のExtracellular DomainにGSTタグを付けて大腸菌ArcticExpressで発現させて、Gulutathione Sepharose 4Bで精製を試みております。 　ただ、溶出効率が非常に悪く、ほぼビーズに残っている状態です。溶出バッファーはビーズ容積に対して2倍量を用いて、組成は50mM Tris, 300mM NaCl, 50mM reduced Gulutathione, 3mM DTT, 0.1% Tween-20, 20% Glycerol, pH8.8です。試薬はその都度作成して溶出前にpH調整しています。溶出は1回1時間4℃でバッチ法で行い500ｇ遠心後に上清のみを得ています。 　GEのトラブルシューティングを見て最適化しているのですが、reduced Gulutathione 20mM→50mM、0.1%Tween添加、pH8.0→8.8としてみて若干は改善しましたが、ほぼビーズに残存しているのは変わりませんでした。 　同じ施設のタンパク質精製部門に相談もしたのですが、「detergentとしてDDMやBOGの添加も考えられるが、こういうstickyになってしまう場合はビーズ上でアグって溶出はあまりうまくいかないよ」と言われてしまいました。 　そこまで言われたら厳しいのかなとも思っているのですが、もし他に溶出効率が改善するような事例がございましたら、ご教授よろしくお願い致します。

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