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(無題) 削除/引用 No.6164-16 - 2017/08/02 (水) 15:12:11 - Ki 一つ便乗質問させてください。 NEBの制限酵素にSDS入りloading bufferが付いてくるので試したことがあるのですが、TAE-agar上でDNA ladder markerを流した場合でもSDS有り・無しで泳動位置のずれがあり、またSDS入りのバンドはSDSなしのバンドよりぼやけた感じでした。そのため、SDS入りloading bufferを避けているのですが、皆さまはこのような経験がありますでしょうか？また、理由として何が考えられるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6164-15 - 2017/07/31 (月) 05:58:22 - YBC 量比も全く同じで流しています。 プラスミドサイズもほとんど一緒です。 ベクターの塩基組成は違うかもですが。。。

(無題) 削除/引用 No.6164-14 - 2017/07/30 (日) 21:05:09 - AP 酵素とDNAの量比も同じですか？ 今回との件とは関係ないと思いますが、 ローディングバッファーは実はバッファー成分がなく、BPBなど色素がかなり酸性であったりするので、十分にバッファーされていないサンプル(例えば純水に溶解したDNA)に加えると、おかしな移動度になります。

(無題) 削除/引用 No.6164-13 - 2017/07/30 (日) 20:39:12 - YBC 確かにTaKaRaの10xLBには0.9%SDSが含まれているんですよね。 トピックをたてた際の文章にDNAへの結合はない酵素だと書いているように、その可能性は低いと思っていたのですが、結果的にはそれが一番あり得そうです。 ただ、矢張り腑に落ちないのは、元のベクターから切り出す際には全く問題なかったことです、同じ酵素とバッファー使ってるのに。。。 それに、問題ないときの700bpのバンドも異常な900bpのバンドも、とても綺麗なシングルバンドなんですよ。 とても不思議です。。。

(無題) 削除/引用 No.6164-12 - 2017/07/30 (日) 17:47:57 - cDNA 以前と同じ酵素で切っているはずが、移動度がずれる、という話はHFの高度が出て来てから多くなったような印象です。下記URLではHFが、というより酵素によってDNAとの結合が強いのでSDS入りのLoading Dyeではがしましょう、というお話です。 https://www.nebj.jp/f/778

(無題) 削除/引用 No.6164-11 - 2017/07/29 (土) 17:16:37 - YBC 皆さんのアドバイスを参考にしつつ色々と試しているうちに、ようやく正しいサイズで泳動させることができるようになりました。 何をやって改善できたかというと、Loading Buffer（LB）をニッポンジーンの6XのものからTaKaRaの10xのものに変えただけです。消化後のサンプルを２分割し、それぞれに別のLBを添加して同時に泳動して確かめたので間違いありません。 ベクターが違う（どちらも特別なものではありません）というだけで、同じ配列を同じ制限酵素サイトで同じ濃度や操作で消化・泳動しているにも関わらず、元のベクターから切り出す時は前者のLoading BufferでOKなのに、今のベクターからの時はNGになる理由がさっぱりわかりませんが、とにかく適切なサイズで泳動できたので安心して（？）以降の実験に用いようと思います。 何か思い当たるようなことがありましたら引き続き教えていただけると有難いですが、とりあえず解決済みとします。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6164-10 - 2017/07/29 (土) 12:04:52 - mon bent DNAだと泳動度は変わります。polyA（A stretch)とか、palindrome配列とか含まれていませんか？

(無題) 削除/引用 No.6164-9 - 2017/07/29 (土) 11:50:58 - qq 染色液を添加してあるゲルで泳動すると、マーカーと試料DNAの移動度が変わる場合があります。 そうであれば、泳動後に染色すると良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6164-8 - 2017/07/29 (土) 11:45:56 - YBC 元のベクターから切り出す際と同じバッファーシステム・酵素で消化しているので、塩濃度の影響というのは考えにくいと思いますが、おっしゃるように精製して流すのを試してみて、またご報告しようと思います。 正直、シーケンスは合っているのだから気にせずに実験を進めるというのもアリだとは思うのですが、気持ちが悪いのでなんとか原因がわかればと思っています。。。

(無題) 削除/引用 No.6164-7 - 2017/07/29 (土) 11:38:18 - 774 切断後に精製して電気泳動してみればはっきりしますね。

(無題) 削除/引用 No.6164-6 - 2017/07/29 (土) 11:37:40 - おお H buffer（だいたい１００mMの塩が入っている）だと結構ずれる。

(無題) 削除/引用 No.6164-5 - 2017/07/29 (土) 11:13:15 - YBC 補足ですが、元々別のベクターに載っている700bpの遺伝子をNdeI/NheIで切り出して、これを現在のベクターに移し替えたという流れになります。 元のベクターから切り出した際の泳動パターン、バンドサイズはもちろん想定通りです。

(無題) 削除/引用 No.6164-4 - 2017/07/29 (土) 10:31:16 - YBC 使用した酵素はNEBのNdeIとNheIです。 いずれもメチレーションには感受性のない酵素ではないでしょうか？ それぞれのシングルカットでは、予想サイズの単一バンドとなります。 実際は、NdeI/NheIの二重消化で別の300bp程度の遺伝子断片をベクターから切り出して除き、その部位にNdeIとNheIサイトを持ったインサートを挿入しています。 通常のユニバーサルバッファーに含まれる塩濃度の影響でそれほど泳動距離が変わることもあるのですか？

(無題) 削除/引用 No.6164-3 - 2017/07/29 (土) 10:19:23 - おお 制限酵素のバッファーの塩濃度の影響じゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6164-2 - 2017/07/29 (土) 10:06:22 - AP 使った酵素、ベクター骨格、消化から泳動までの手順の情報出せますか？ 単独酵素での消化はどうなりますか？ 無理やり考えると 一方の酵素はメチル化かなんかできれてない。 もう一方の酵素は見落としているかスター活性で切断部位がもう一ヶ所ある。それで切れた断片が900 bp

制限酵素消化後のサイズが合いません 削除/引用 No.6164-1 - 2017/07/29 (土) 09:49:58 - YBC ある遺伝子を挿入したプラスミドをそれぞれユニークな制限酵素２種で切断して泳動したところ、本来700bpの断片が得られるはずが、何度やっても900bp程度のシャープなバンドのみ（ベクター由来のバンドはもちろんあります）が観察されます。プラスミドのシーケンスはインサートの両側から複数回読んで間違いがなく正しい位置に２種の制限酵素サイトが存在することを確認していますし、念を入れてサブクローニングの方法を変えて（通常の制限酵素クローニングとIn-Fusionクローニングで行いました）新たに単離したクローンについても同様でした。切断後のDNAに結合したままになるような制限酵素もありますが、使用したのはそういう類のものではありません。#6160のトピックも読ませていただいたのですが、どのようなことが考えられるか、また解決策など教えていただけると幸いです。よろしくお願いいたします。

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