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(無題) 削除/引用 No.6163-4 - 2017/07/29 (土) 09:27:42 - phos おおさん、APさん、レスありがとうございます。 おおさんの点ですが、PNK→フェノクロ→エタ沈のみで、フリーのATPはエタ沈で一部除かれているであろうとはいえ、まぁほとんど除けていないのではないかと思います。 APさんのアドバイス、あぁなるほど！！そういえばThermoのPNKを使っていますが、Buffer AとBuffer Bがあり、Bは特に交換反応向けに最適化されているだったかのような感じで、一度も使ったことがなかったので完全に失念していましたが、当然Forward反応用のBuffer Aを使おうと交換反応が0になるわけではないですよね。 なるべくオリゴがリン酸化して欲しくない場合、あまり長時間のリン酸化は避けるべきという感じですね（今回はなるべくRNAをたくさんリン酸化したかったので、結構長時間反応させてしまいました）。 ともかく原因も分かりスッキリしました、どうも大変ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6163-3 - 2017/07/29 (土) 09:11:09 - AP いや、PNKは交換反応も起こすから。酵素活性の記載を確認してごらんなさい。 あらかじめ付加していた非放射性リン酸がフォスファターゼ活性で除去されて放射性リン酸の転移反応が起こってるんでしょ。 フォスファターゼ活性を除去した改変型PNKもあるようだから、それを使ったら。

(無題) 削除/引用 No.6163-2 - 2017/07/29 (土) 08:53:54 - おお ＞PNK処理後泳動した結果 泳動条件は？フリーのリン酸は除いた？

DNAオリゴのリン酸化 削除/引用 No.6163-1 - 2017/07/29 (土) 08:45:30 - phos 5'末端がリン酸化されているDNAオリゴはPNKでリン酸化できないと思うのですが、DNAオリゴをアニーリングさせたRNAをPNKでリン酸化（[32P] ATPで）するという実験を行う上で、DNAオリゴの方はリン酸化されて欲しくなかったため、合成オリゴを5'末端リン酸化のオプションで注文しました。 PNK処理後泳動した結果、どうも過剰量入れた合成オリゴもがっつりリン酸化されてるような結果になったんですが（とはいえ詳細な解析はしておらず、単にサイズからの判別のみです。ひょっとしたらラベルされたRNAの分解産物かもしれません）、合成オリゴのリン酸化というのはそもそも100％じゃないんでしょうか？理論上100％リン酸基を持つはず、なのか、理論上100％に近くリン酸化されていることなど絶対にありえない、なのかすら判断できないので（もし後者ならば、割と高いオプションをつけるぐらいなら自分でリン酸化した方が良さそうな気もしますが、どうなのでしょうか…）、ご存知の方がいらっしゃいましたらご教示いただけると大変助かります。

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