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(無題) 削除/引用 No.6160-7 - 2017/07/29 (土) 04:04:22 - おお わたしも増えたものがミスアニーリングしているような気がします。バンドがシャープなのは起こりやすいミスアニーリングのパターンがあるからでしょう。 ９５度で一度変性させるなら、時間をかけて温度を下げることをおすすめします。たとえば５００mlのビーカーなどの水を沸騰寸前まで温めて、サンプルの入ったチューブを入れて、自然に冷めるのをまつとか。 また６０ー７０度でしばらく温めると解消されるかもしれません。 また、完全に変性させて、変性状態で泳動してしまうほうが（８MウレアがはいったPAGEなど）早く解決するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6160-6 - 2017/07/28 (金) 23:53:11 - 大学院生 コメントありがとうございます。よくあることなんですね。知り合いが、このような方法で新規のスプライシングバリアントを発見したので、この小さいサイズのバンドも同じような新規バリアントであることを期待していたのですが… >JHさん 試しにNaOHででもPCR産物を処理してみて、バンドの濃淡が変わるかどうか見てみようと思います。 >APさん 確かにサイクルは過剰かもしれません（350bpのバンドはx28でも充分みられるけれど、x35で行っています）。発現量の少ないバリアントがあるという仮説を元にPCRをかけたので、サイクルを多めにしました。 仰るとおりにPCR産物同士のアニールが起こった場合、部分的に一本鎖になっている領域の長さはランダムで一定にはならず、アニールを起こしたPCR産物同士でまちまちになるように思います。であれば電気泳動で見られるバンドの大きさもまちまちになるような気がするのですが、出てきた250から300bp位のバンドというのはかなりシャープなシングルバンドに見えるのですが、そういうものでしょうか？ PCR産物からエタ沈かなにかでプライマーを除去した後、95度2分で全てのPCR産物をdenature、アニーリング温度で充分長い時間(5分とか？）処理、などとすれば「部分変性した、二重鎖」（部分的一本鎖？）を避けることが出来るかなあなどと考えたのですが、このアイデアはどうでしょうか？ >774Rさん プラスミドにクローニングしたものであれば間違いなくモノクローンですよね。それでもバンドが二本出ることもあるんですね。実験は奥が深くて面白いなと思います。

(無題) 削除/引用 No.6160-5 - 2017/07/28 (金) 22:00:22 - 774R ごく稀にですが、おそらく立体構造が原因でバンドが2本になることがあります。 プラスミドにクローニングした約450bpのインサートを制限酵素で切って泳動すると本来のバンドの下にもう1本バンドが現れることがありました。 レアケースではありますが一応…

(無題) 削除/引用 No.6160-4 - 2017/07/28 (金) 20:08:02 - AP 多個体からとったRNAのプールだとSNPがあるかもしれなくて、SNPの異なる相補鎖が上記のようにしてheteroduplexをつくると、これまた移動度のずれたバンドになる。いずれにせよ、過剰なサイクルが原因。

(無題) 削除/引用 No.6160-3 - 2017/07/28 (金) 15:37:15 - AP おそらく不正な対合をした、言い換えると部分変性した、二重鎖じゃないでしょうか。 サイクルが過剰だったりしませんか？ サイクル過剰だとPCR産物の濃度が高いために、熱変性した後、プライマーがアニールして新規鎖が合成されて完全な二重鎖になるほかに、PCR産物同士のアニールも起こりやすくなってきます。これは鎖長が長いためプライマーのように短いアニール時間では完全な二重鎖に戻ることができず、部分的に一本鎖だったりするんでしょうね。移動度がずれます。 例えば、プラスミドを精製するときアルカリ処理が過剰だとcccよりやや移動度の大きい、ゴーストバンドがでることが知られていますね。 というようなことは、以前も書き込んだかも知らん。

(無題) 削除/引用 No.6160-2 - 2017/07/28 (金) 14:10:32 - JH よくあります。 ２本鎖のDNAがほどけて１本になったものではないでしょうか。 たぶんアプライするサンプルの塩濃度を調整したりすると、濃くなったり薄くなったりすると思いますよ。

RT-PCRで目的サイズのバンドの下にうっすらと出るバンド 削除/引用 No.6160-1 - 2017/07/28 (金) 12:46:12 - 大学院生 よろしくお願いします。 ごく普通のRT-PCR （細胞から抽出したtotal RNAを元にcDNAを作成、このcDNAをtemplate DNAとしてPCRをかける）をしています。目的のバンド(350bp）はくっきり出るのですが、その下、250から300bp位の大きさに薄いバンドが見られます。 スプライシングバリアントの可能性を考えて、このバンドを切り出してみようとしたのですが、上手に切り出せていないのかそれともこのバンドは偽者（？）なのか、PCRをかけたときのプライマーでシークエンスを読もうとしても読めませんでした。 単なるノンスペの可能性もある（というか高い）が一応確認しようと、切り出したDNAをTベクターに入れてから読んでみたところ、目的の350bpのDNAのシークエンスそのものでした。 RT-PCRでこのような現象 1）目的サイズとは明らかに違う、少し小さいサイズのバンドが出てくる　 2）しかし、ゲル上でのサイズの違いにもかかわらずこのバンドは目的のPCRプロダクトそのものである はよくみられることでしょうか？ 自分の実験に直接関係ないトピックでもこの掲示板を見るのが好きで、以前どなたか常連の方がこのような現象に対して説明をされていたようにうっすら記憶しているのですが、それっぽいトピックを過去ログから見つけられませんでした。 どなたかこのような現象に説明をつけられる方がおられたら、よろしくお願いします。

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