全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.616-14 - 2012/06/12 (火) 19:44:05 - まるやま うさん、Qさん 御助言をありがとうございます。意図がよく判りました。日頃、血中濃度の測定などしかしていないもので、認識不足でした。すみません。 御助言も含めて考えると、次のように考えます。 （１）アクチンなどの内部標準もEIAで測定をして、目的タンパクのためのEIA測定に用いたサンプル中の内部標準量で補正して統計解析する場合 （２）EIAで測定する場合に、蛋白総量を一定にするようにして、内部標準量による補正をせずに統計解析する場合 （１）と（２）の両方をしてみた方が良さそうだと考えます。

(無題) 削除/引用 No.616-13 - 2012/06/12 (火) 18:15:01 - AP >面倒くさいと言いつつ、質問には何一つ答えていないｗ 質問というよりは >是非、皆さんの御意見をお聞かせください。 ということなので、責められる点ではないように思うけれど。 しかも、親切にも、 >やること決まってるなら、聞かずにさっさとやれや。 という、実に的確なアドバイスもしてくれているんだし。 >質問には何一つ答えていないｗ のは、あなた自身ではないか！

(無題) 削除/引用 No.616-12 - 2012/06/12 (火) 16:13:36 - yyy >[Re:10] ppさんは書きました : > あぁ、もうめんどくさ。 > > こんな変な質問者なんて無視に限る。最初から何が聞きたいのかわけわからん。 > やること決まってるなら、聞かずにさっさとやれや。 　 面倒くさいと言いつつ、質問には何一つ答えていないｗ 誰もあんたに頼んでないんだから、面倒なら無理して書き込む必要ないのにｗ

(無題) 削除/引用 No.616-11 - 2012/06/12 (火) 14:59:30 - ~ >[Re:7] まるやまさんは書きました : > 追伸。もちろん、同一の蛋白総量をEIAするのは当たり前の話です。 目的とサンプルの性質を考慮した上での判断なのでしょうか？ 複数の前提条件を満たしていれば成立しますが、 ここに書かれている条件だけでは目的を達成できない結果が得られうる方法です。

(無題) 削除/引用 No.616-10 - 2012/06/12 (火) 13:11:36 - pp あぁ、もうめんどくさ。 こんな変な質問者なんて無視に限る。最初から何が聞きたいのかわけわからん。 やること決まってるなら、聞かずにさっさとやれや。

(無題) 削除/引用 No.616-9 - 2012/06/12 (火) 13:09:31 - Q EIAは培養上清にある分泌タンパク質を確認するときは確かに有用でウエスタンより簡単です。ですが、まるやまさんの場合、組織を比較ということは組織をすりつぶしたりしてサンプルを調整するわけですよね。 私もタンパク質量をそろえるのは難しいと思います。同じ重さをすりつぶしたとか、Bradford法やBCA法などやり方はありますが、最終的に同じタンパク質量とするでしょうけど、 私はEIAで内部標準的なものを検出して比較しようとしましたが、内部標準がタンパク質量が同じであるのに結構違ったことがありました。 これを、実験が下手だからと言われればそれまでですが、ウエスタンでゲルから転写される量が違うとかありますが、EIAでもタンパクの吸着とか一定であるはずのものが一定であるとも限りません。 サンプルの多さでウエスタンは難しいですが、EIAでやるのはどうも最初から決まっているようなのでなんですが、気をつけて頑張って下さい。 あと、やっぱり回答に対する対応は考えましょう。

(無題) 削除/引用 No.616-8 - 2012/06/12 (火) 12:49:14 - う どうも最初から、ELISAひいきのようですが 皆に意見を求めるとき、ご自分の考えと合わない回答に対して 否定するだけなら、最初から意見を求めることに何の意味があるのか と思いながらも どうも私の回答は気に入らないものだったようですので 申し訳ありません。 ウエスタンのばらつきを思いつくすべて挙げていらっしゃるのであれば、 ELISAのことも少し慎重にと思った次第です。 最後に、老婆心ですが、私の経験上、 タンパク質を定量して、同じ量にしているバズということ程 ばらつくが多いということ、 実は同じ量にするということは難しいことである ということです。 そのコントロールをした上での結果は、それはアクセプトされます。 ただ、同じ量にすることは難しいということです。

(無題) 削除/引用 No.616-7 - 2012/06/12 (火) 08:02:05 - まるやま 追伸。もちろん、同一の蛋白総量をEIAするのは当たり前の話です。

(無題) 削除/引用 No.616-6 - 2012/06/12 (火) 08:00:10 - まるやま うさんの考え方は、当方はしません。 ウエスタンの場合には、同一ゲル内でも転写のバラツキをはじめ様々な要因ににより、たとえ完全に同一タンパク量を分析してもばらつきます。異なる泳動ゲル・メンブレンの場合はそれ以上にバラツキます。さらに、これらは統計解析ではカバーしきれません。さらに、アクチンなどの内部標準が、異なる群間で一定量であるというのは、仮定にすぎず、ちゃんと調べるのも無理です。 一方、EIAの場合は、タンパク定量の際やEIAの際に、デュプリケートやトリプリケート、場合によってはそれ以上の多重測定も可能です。そしてEIAでの測定結果は、論文のM&Mの中で測定間変動や測定内変動を記述し、それが読者から許される程度であれば、適切な統計解析（もちろん濃度算出段階、ならびに、得られた測定結果をANOVAなどで解析する段階の両方です）によって、母集団の差を推定できます。 現状、イムノアッセイ以上に良い定量法が無いです。未来には別の技術がでてくるかもしれませんが、現時点では多くのレフェリーや読者からアクセプトされる考えだと思います。

(無題) 削除/引用 No.616-5 - 2012/06/12 (火) 00:26:48 - う どちらの方法であれ、サンプル間のタンパク量を同じにしないと目的タンパク質の定量みたいなことは難しいとは思わないのでしょうか？ ウエスタンでは、タンパク量が誤ってちょっと違った時に、インターナルコントロールでその違いに気づくかもですけど、ELISAではタンパク量が重要ですが？

(無題) 削除/引用 No.616-4 - 2012/06/09 (土) 06:38:25 - まるやま 御意見をありがとうございました。 今のところ、次のように考えています。 （１）ランダムに選んだ少数のサンプルのみウエスタンをする。これはバンドの出方に、群間差が無いことを確認するため。弱いバンドの方が重要かどうかは現時点では不明な事も理由です。 （２）その後に、全サンプルを用いた定量は、EIAで実施する。

(無題) 削除/引用 No.616-3 - 2012/06/08 (金) 09:36:55 - ~ >弱いバンドが他に一つあります これの生理学的な機能は考慮すべきと考えているのでしょうか？ また、WBで見た時に、レーンの全intensityの何%に相当するのでしょうか？ (2)、(3)は技術上の話で済みますが、(1)は対象物（組織、タンパク質）によって変わる話でしょう。 メインのバンドの10,000倍の生理活性のあるタンパク質のバンドであれば、そちらが事実上のメインバンドかもしれません。 それぞれの系で、100サンプルの定量をするのに必要なリソースや時間を計算してみてはいかがでしょうか。 私ならば、市販のEIAキットで対応しているものがあり、プレートウォッシャーが確保できるのであれば、EIA一択で考えます。 また、EIAを使うのに多大な労力がかかる場合は、WBではなくdot blotを検討すると思います。

(無題) 削除/引用 No.616-2 - 2012/06/08 (金) 06:44:40 - (^o^) westernで定量的評価するなら検量線書いて直線性のある範囲を知ったうえでそこに収まるような条件で見る事が必要だな。これは大事だな。論文でwesternで定量って？ハア？見たいに言うレビュアーは3人に一人はいるから、『ええ先生そんへんは私もね、ちゃんとやってるんですよ』的にそういう検量線データも図のインサートとかでさりげなく載せれば、あんまりそういうこと言われない。 異なるメンブレン間での比較はとても難しいから、泳動距離短くするとか、目的の分子量付近でゲルを切るとかしてゲルちいさくして、１枚の膜に複数のゲル載せて転写するとか工夫が必要だな。 2倍以上の差(目で見て分かるくらいの差）があるようなら、ウェスタンでも再現性よく苦労せずクリアな定量的データ出ると思うが、1.3倍だとかの差だと、正直ウェスタンでみるには限界と思うので、さっとあきらめてEIAでやったほうが得策だな。 まあ、いずれにせよ、別に悩むほどの問題じゃないと思うんで、いけそうなほうでやればどうよ。

定量のためにはウエスタンブロットかEIAか 削除/引用 No.616-1 - 2012/06/07 (木) 21:15:09 - まるやま お世話になります。 ある組織で発現しているあるタンパクの定量をはじめようとしています。 既報では、ウエスタンブロットを実施すると、バンドはきわめて強いバンド一つだけですが、弱いバンドが他に一つあります。そこで同一抗体を用いて、多数（100以上）の同一組織由来のサンプルの定量をしたいと考えています。 このような目的の場合、使用する方法は、EIAで良いでしょうか？それとも、ウエスタンブロットを実施すべきでしょうか？当方はウエスタンには次のような長所と短所があると考えています。 （１）メリットとしては単一バンドであるかどうかを確認できる （２）一枚のメンブレン内でも転写や発光の段階などでバラツキが出やすく、メンブレン間でもバラツキが出やすいので定量法としては不正確 （３）ゲルのウェル数（マイナス、分子量マーカーや陽性コントロール）が最大サンプル数になるという数の制限がある。 そしてEIAのメリットは、ウエスタンとは逆です。 このような状況で悩んでおります。是非、皆さんの御意見をお聞かせください。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---