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(無題) 削除/引用 No.6152-14 - 2017/07/25 (火) 18:12:22 - AP コンタミのせいでmutationが起こるとは考えられにくいけどね。 インサートにコードされる遺伝子が毒性であることが原因であることを想定して、対策を考えておくことをおすすめする。 毒性のため生えてくるクローンはみんなmutantという事態は珍しくなく、うちの研究室でも、このところ一年に一回くらいの頻度で起こっている。

(無題) 削除/引用 No.6152-13 - 2017/07/25 (火) 17:20:37 - とむ >[Re:10] APさんは書きました : > >シークエンシング前なので、発現させることができない原因がミューテーションであるという推測が理解できません。 > > 生えてきたクローンのシークエンスはもちろんしてるんでしょ。それがみんなmutantだった。そこでインンサートとして準備したPCR産物をダイレクトシークエンスする。 > って話だと読めましたが。 APさん その通りです。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6152-12 - 2017/07/25 (火) 17:19:21 - とむ みなさま お礼が遅くなり申し訳ありません。 cDNAからクローニングしたプラスミドをシークエンス解析に出したところ、塩基の変異が多数入っていました。先輩に相談したところ、再度PCRでインサートを増やし直し、ダイレクトで出してシークエンスを確認した後、正しいと確認できたらプラスミドにいれてクローニングしてみてと言われました。その際に、ダイレクトシークエンスで５本出してほしいと言われまして、私はテンプレートになる細胞を１種類しか持っていませんでしたので、頭を抱えていたわけです。 ただご指摘の通り、私の誤解でした。先輩との間で伝達不足があり、テンプレートが５種類用意できるので、それぞれで走らせてダイレクトシークエンスで確認してほしいということでした。色々問題があってなかなか教員の方や先輩が捕まらず、実験も進まなかったので焦ってここで質問してしまいました。読み返してみるととても拙い文章で失礼いたしました。 大腸菌でのミューテーションですが、少し前にSOC培地にプラスミドがコンタミし、耐性遺伝子を持たないのにコロニーが増える事件があったそうで、ちょうど私がクローニングしている時期に使っていた培地やコンピもコンタミの可能性があったようです。現在はそれらを一新して問題なく動いているそうなので、新しいコンピテントセルや培地で再度クローニングしてみます。

(無題) 削除/引用 No.6152-10 - 2017/07/25 (火) 16:52:28 - AP >シークエンシング前なので、発現させることができない原因がミューテーションであるという推測が理解できません。 生えてきたクローンのシークエンスはもちろんしてるんでしょ。それがみんなmutantだった。そこでインンサートとして準備したPCR産物をダイレクトシークエンスする。 って話だと読めましたが。

ありがとうございます。 削除/引用 No.6152-9 - 2017/07/25 (火) 16:51:45 - とむ

(無題) 削除/引用 No.6152-8 - 2017/07/25 (火) 16:33:30 - ~ ×N末⇒○C末

(無題) 削除/引用 No.6152-7 - 2017/07/25 (火) 16:32:09 - ~ シークエンシング前なので、発現させることができない原因がミューテーションであるという推測が理解できません。 制限酵素地図のパターンが違うなどで配列の違いを把握している？ それともN末側が欠損したタンパク質が検出されている？ クローニングで得られた複数のコロニーからPCRで増やした産物をシークエンシングすることで、たまたま外れのコロニーを引いたのではないという結論を出したいのであれば、その複数が5個としているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6152-6 - 2017/07/25 (火) 16:19:59 - おお 書いていることがいまいちわからん。 一つのcDNAライブラリーから５回別々にPCRした産物をシーケンスにかけるってこと？まあそうだとあまり意味はないけど、万が一かからなかったときのバックアップとして２つほどということはあるのかもしれない。 ５種類の由来がちがうcDNAからならケースによってはありえるかもしれない。 PCRでのエラーならプラスミドのクローンを数個読む必要があるかもしれないが、そうとは書いてないよね。 今までに得られた結果により判断が変わるところでもあるし、まずはそう指示した人としっかり話し合うべきじゃないかな。意図によってもアプローチが変わるものだし。 それで納得がいかなかったらちゃんと状況を提示してここに上げた方が回答する人も書きやすいと思うし、今のままだと部分的に勝手に想像して回答書かないといけない部分があるので、想像が外れていたらあなたにとって有害な回答になる可能性もあるし。

(無題) 削除/引用 No.6152-5 - 2017/07/25 (火) 14:29:01 - 中年 PCR産物をシークエンスすることについてはAPさんのおっしゃるとおりだと思いますが、ボス（？）が言ってることを誤解している可能性はありませんか。例えば、大腸菌のコロニー５個からコロニーPCRをして、その産物をダイレクトシークエンスするように言われたとか。

(無題) 削除/引用 No.6152-4 - 2017/07/25 (火) 11:05:12 - mon APさんに賛成ですが、 Mutationって、どのようなものでしょうか？ いつも（どのクローンでも）同じ部位にあるのでしょうか（もしそうなら鋳型由来かも？）？ あるクローンのMutationが一ヶ所ならそのMutationを是正するprimerを新たに作って再クローニングする、とか。それでも他の部位にMutationが入る場合は、APの指摘どおり大腸菌に毒性がある（予期せぬ毒性タンパクが発現する）可能性が高い。。 ベクターがpUC由来oriなら低温(25℃程度）で培養すると大腸菌内でのcopy数が減るので、もしかしたらクローニングできるかも（扱いづらいけど）。 残る手段ははベクター・菌株を変える、人工遺伝子（コドン改変）とか。。

(無題) 削除/引用 No.6152-3 - 2017/07/25 (火) 10:24:57 - AP あと、どうして５本シークエンスするのか、そう命じた人と討議すればいいことなんじゃない？ 誰が見ているか分からないインターネット掲示板。もしその人が見たら、書き込んだのがあなただということはまるわかりの内容。気ィ悪いんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.6152-2 - 2017/07/25 (火) 10:04:02 - AP それで５本出しても同じ結果が返ってくるでしょうけどね。 おそらく、ダイレクトシークエンスをすれば、個々の塩基ごとに変異を起こしたDNA分子は少数派なので、読めてくるのは野生型の配列となるでしょう。多少は変異型の波が見えるかもしれないけど。 問題はそこじゃなくて、 多分、野生型の産物は大腸菌に毒性があり、結果として変異が入ったクローンしか生えてこないのでしょう。

クローニングの際のダイレクトシークエンス解析について 削除/引用 No.6152-1 - 2017/07/25 (火) 09:45:40 - とむ いつも勉強させて頂いております。 現在2kb程度の分子をクローニングするのに、制限酵素をつけたプライマーでPCRしサブクローニングを行なっています。 しかし、途中でミューテーションが入ってしまい発現させることができません。 そこでインサートを増やした際にダイレクトシークエンスで解析に出すように言われたのですが、その際ダイレクトで5本程度出せと言われました。 同じPCR産物を同じプライマーで解析に出すことは意味があるのでしょうか？ ご意見よろしくお願いいたします。

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