全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.6143-7 - 2017/07/22 (土) 07:53:09 - おお http://www.nature.com/nature/journal/v530/n7590/fig_tab/nature16937_SF2.html 内部につけたものは見当たります。 立体構造については、なるだけ構造ドメインを遮らないようにするか、ヘリックスやベーターシートなどの間のループにつけるという手が取れますが、後者はとくにそのループが機能に重要な役割をしているかで、蛋白の活性が変わってくる可能性があります。 細胞外ということなのでFLAGはネガティブチャージのアミノ酸が多いので細胞外へのトポロジーにはあまり影響はなさそうです。個人的にはトポロジーに大きく影響する膜貫通ドメインの周辺から離れたところにおいたほうがいいような気がします。 ただあれこれ理屈が言えても実際はやってみないとわからないと言われれば、反論できません。 抗体のアクセスに関しては近くに大きな糖鎖修飾があれば検出しにくくなるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.6143-6 - 2017/07/21 (金) 17:40:21 - mon クローディンの高次構造は全てのファミリー遺伝子ではないですが、明らかになっていますね。。 細胞外ドメインは、クローディン同士の結合に必要なようで、タグを挿入するスペースは一見なさそうですね。小さなFLAGタグならN末に付加で良さげですが、細胞外に拘るのはliveで観察したいからでしょうか。 N末テトラシステインタグも使えそうです。。

(無題) 削除/引用 No.6143-5 - 2017/07/21 (金) 15:28:57 - かわ mon様へ、 すいません。読み飛ばしておりました。 クローディンですので、4回膜貫通で、ER膜から細胞膜へと移動すると思います。EDTAでどのように細胞内に入るのかはちょっと不勉強でわかりません。 細胞外ドメインはER小胞内にあるはずです。

ありがとうございます！ 削除/引用 No.6143-4 - 2017/07/21 (金) 15:26:03 - かわ monさまへ、 ありがとうございました。 説明不足ですいません。あまりタンパクの名を上げると良くないと言われるので伏せていたのですが、タイトジャンクションタンパクのクローディンです。 EDTAとかで2価のカチオンを除くと細胞膜から細胞内に移動します。 やはりループの真ん中付近でできるだけ高次構造に影響を与えないように配慮してということですね。情報がすべて出ているわけではありませんからやはり試行錯誤が必要ですね。了解です。

(無題) 削除/引用 No.6143-3 - 2017/07/21 (金) 13:11:28 - mon タンパク内部にタグをいれることが可能な場合もあります。 高次構造が解明されていると予測しやすいですが、そうでなければ、alpha-helixやbeta-sheet構造領域を避け、タンパク表面に存在する思われるそれらの間のヒンジ・ループ部分に挿入します。 ただし、もし目的タンパクが刺激等で高次構造変化を起こす場合はもちろん通常状態でもtagが構造に影響する可能性もありますので、試行錯誤（複数作成して試す）が必要です。

(無題) 削除/引用 No.6143-2 - 2017/07/21 (金) 13:03:47 - mon 細胞外ドメインがあるのに、「細胞内部から細胞膜に移行」とはどういうことでしょうか？ それとも(1)通常は細胞膜膜内側に張り付いていて、細胞膜外側に移行（細胞表面に露出）と言うことでしょうか。 (2)ER膜（あるいはゴルジ膜）等から細胞膜に移行（細胞表面に露出）と言うことでしょうか。 (2)の場合、「細胞外ドメイン」はER内にあると言うことでしょうか。 (2)の場合、目的の膜タンパクはI型、II型、複数膜貫通型タンパクでしょうか？

flag tagのタンパク内部への挿入 削除/引用 No.6143-1 - 2017/07/21 (金) 12:46:20 - かわ いつも勉強させてもらっています。 ある膜タンパクが細胞の状態によって細胞内部から細胞膜に移行するのを捉えるためにflag tagを細胞外ドメインのなかに組み込んで抗体で検出することを考えています。 細胞外ドメインを認識する抗体があれば簡単なのですが、まず市販の抗体で細胞外ドメインを認識するものが存在しないのと、そのタンパクのファミリーで細胞外ドメインに対する抗体を作成するのがとても困難であることが知られているため、とりあえずの策としてタグ抗体での検出を考えていると言う次第です。 flag tagは一般的にはNまたはC末端に付けるみたいですが、タンパク内部でも問題ないでしょうか？ 次のような問題の可能性を予想しております。 １．タグの挿入によってタンパクの局在が変化してしまう。 ２．タグの挿入によってタンパクの立体構造、機能が変化してしまう。 ３．内部に挿入したタグは抗体によって認識されにくい。 disulfide bondsを予想するプログラムによると、細胞外ドメインのなかに１つC-C bondが形成されているみたいですので、その中に入れるのは避けた方が良さそうです。また細胞膜ドメイン近傍は抗体が近づきにくい気もします。 恐らくケースバイケースということになろうかと思うのですが、どなたか、このような案件にお詳しい先生がおられましたら、どのあたりにタグを入れた方が良いとか、注意点とかを教えて頂けますと助かります。 すいませんがよろしくお願いします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---