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Rnase inhibitorはDTTだけでOK? トピック削除
No.6135-TOPIC - 2017/07/19 (水) 07:05:15 - ポン吉
いつもお世話になっております。
この度逆転写反応に関して質問がございます。

RTのKitにはよくDTTがついておりますが、こちらはRnase inhibitorとして働くものと認識しております。ただ一方でRnaseOUTのようなRnase inhibitorも市販されており、使うことが推奨されていることがあります。

推奨されているということは、
DTTだけだとRnaseを完全には阻害出来ないということなのでしょうか？
現在大量のTranscriptome実験を抱えており、RNAの分解を防ぎつつ、お金も節約したいと考えております。DTTだけでも効果的にRnaseを阻害できるなら大量にRnaseOUT等を買わなくてもいいのに、と思っているのですが。

どなたか詳しい方がいらっしゃいましたら教えてくださると幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.6135-5 - 2017/07/20 (木) 02:53:57 - おお
>[Re:3] ポン吉さんは書きました :
> おおさん有難うございます！
>
> 自分でも色々調べてみました。
> こちらの論文のアブストラクトにはDTTがRnaseを抑えると書いてあるのですが、結構胡散臭いのでしょうか。。。？
> RNase activity requires formation of disulfide bonds and is regulated by the redox state. Plant Mol Biol. 2004 May;55(1):83-96.
>
> ポン吉

例えば細胞外で見られるRNAではればS-S結合は重要な役割をになっているでしょうけど、S-S結合があまり見られない細胞内のRNaseはどうなんでしょうか。RNase Lとかちらっと調べた限りS-Sはないようですし。

文献はそのデーターの範囲では正しいでしょうけど、RNA精製はそう簡単には行きませんし。

(無題) 削除/引用
No.6135-4 - 2017/07/19 (水) 09:39:30 - AP
>RTのKitにはよくDTTがついておりますが、こちらはRnase inhibitorとして働くものと認識しております。

ちがうよ。おおさんの言うとおり。
ジスルフィド結合を切るほど高濃度のDTTは入ってない。酵素やRNase inhibitorなどのタンパク質の酸化から保護するために低濃度で加えられている。

RNA精製でちゃんとRNaseが除去できていれば、RNase inhibitorは必須でない。
うちでもルーチンでは RT反応にinhibitorは入れていない。

最近むしろ問題があると思っているのは、DNase処理後の熱失活、RNA変性のための加熱処理や高温でのRT反応。二価カチオン存在下で加熱するとRNAが分解される。

Rnase inhibitorはDTTだけでOK? 削除/引用
No.6135-3 - 2017/07/19 (水) 08:11:19 - ポン吉
おおさん有難うございます！

自分でも色々調べてみました。
こちらの論文のアブストラクトにはDTTがRnaseを抑えると書いてあるのですが、結構胡散臭いのでしょうか。。。？
RNase activity requires formation of disulfide bonds and is regulated by the redox state. Plant Mol Biol. 2004 May;55(1):83-96.

ポン吉

(無題) 削除/引用
No.6135-2 - 2017/07/19 (水) 07:22:34 - おお
DTTはRT enzymeの活性に必要です。またRNase Inhibitorの活性維持にも必要です（最近はDTTなしでも活性維持できるものが売り出されるようになりました）。DTT単独でRNase Inhibitorの活性があると聞いたことはありません。また、RNase Inhibitorを入れても気をつけないとRNAが分解されてしまうことはまあまああります。

Rnase inhibitorはDTTだけでOK? 削除/引用
No.6135-1 - 2017/07/19 (水) 07:05:15 - ポン吉
いつもお世話になっております。
この度逆転写反応に関して質問がございます。

RTのKitにはよくDTTがついておりますが、こちらはRnase inhibitorとして働くものと認識しております。ただ一方でRnaseOUTのようなRnase inhibitorも市販されており、使うことが推奨されていることがあります。

推奨されているということは、
DTTだけだとRnaseを完全には阻害出来ないということなのでしょうか？
現在大量のTranscriptome実験を抱えており、RNAの分解を防ぎつつ、お金も節約したいと考えております。DTTだけでも効果的にRnaseを阻害できるなら大量にRnaseOUT等を買わなくてもいいのに、と思っているのですが。

どなたか詳しい方がいらっしゃいましたら教えてくださると幸いです。
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