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(無題) 削除/引用 No.6129-15 - 2017/07/20 (木) 09:12:41 - X 293Tでのリン酸カルシウムは、ちゃんとやれば非常に高い導入効率が得られますよ。タンパクレベルで定量確認した事はありませんが、ウイルスベクターのパッケージで、Lipofectamin2000やFugene6（LTXとかHDとかではないですが）と比較した事があり、ウイルスタイターで5倍以上、ほぼ10倍に近いレベルでリン酸カルシウムの方が高かったです。なので、私個人としては、おおさんのコメントに全く違和感がありません。 レンチのパッケージでタイターを追求するのであれば、リン酸カルシウムは選択肢に入ると思います。ただ、プライマリーの上皮細胞は、リン酸カルシウムではまず無理と思いますし、学生さんが使うとなると、リン酸カルシウムはちょっと難しいですね。

(無題) 削除/引用 No.6129-14 - 2017/07/19 (水) 00:20:57 - PCR おおさん、返信ありがとうございます。 正直なところ、蛍光強度での比較は自分は絶対に信用しないことにしているのと、ポンソーの話はおそらく別の試薬でも見られるだろうと思う（でなければその差は10倍どころではきかないと思われるので）ので、自分としてはにわかには信じにくいのですが、次回リン酸カルシウムを使う機会があれば比較してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.6129-13 - 2017/07/18 (火) 23:44:06 - おお そうそう１０倍というのは想像で言っていました。そこはお詫びいたします。GFPなどだと、WB用の膜をPonceauで染めただけでGFPのバンドが確認できたりもします。

(無題) 削除/引用 No.6129-12 - 2017/07/18 (火) 23:38:52 - おお >これはどうやって定量されたんでしょうか？ウェスタンブロット？ 当方、FuGene6やLipofectamine2000でHEK293に発現させてましたが、どちらの方法でも、GFPで発現をチェックすれば顕微鏡ほぼ全ての細胞で発現しているのを確認できましたし、 リン酸カルシウムのほうが細胞の蛍光強度が明らかに強いです。GFPをTransfectionしたのにEGFPなみと思えるくらいです。

(無題) 削除/引用 No.6129-11 - 2017/07/18 (火) 23:37:19 - AU いろいろ情報ありがとうございます。 フナコシのキャンペーンは、海外なので利用できず残念です。 jetPRIME は、Xtremeと同じポリマー系ですね。 トランスファクション効率比較するなら、蛍光ファックスか、ルシベクター、翻訳され辛いものなら、ウェスタンでもじゃないですかね。 ファックスしなくても、デジタルのセルカウンターならgfp細胞カウントしてくれるのもありますね。レンチのタイターチェックとか使ったりしてます。 わざわざ、それ目的じゃないなら、ウェスタン？じゃないでしょうか？ 試薬変えるくらいなら、レンチやアデノした方が早いのは、その通りですね。 ほとんど、レンチだと思います。 アデノは、一度作れば楽なのですがベクター作るのか手間なので、個人的にはルーチンにしづらいですが、発現量稼ぎたいときは、レンチより良いですね。 分化の解析だったりすると、レンチでステーブル化してしまうのが返って邪魔だったり、何かは発現持続するようにレンチで、他はトランスジェントで幾つかコトラしたいみたい、なんて状況を想定してます。 誘導発現プロモーターとか、後から組みこみ配列抜けるレンチとか、手間かければ方法はありますが、ただかけるだけで行ければ、嬉しいところです。 今後、ラボでみんなが使えると言うのもあり、ある程度簡単で汎用性があると言うところも大事です。ポリマー系かな

(無題) 削除/引用 No.6129-10 - 2017/07/18 (火) 23:01:24 - PCR 本題から少し外れてしまいますが、おおさんに質問が。 >293でリン酸カルシウムを使うと、リポフェクションなんかと比べると１０倍ぐらい発現量が高かったりする これはどうやって定量されたんでしょうか？ウェスタンブロット？ 当方、FuGene6やLipofectamine2000でHEK293に発現させてましたが、どちらの方法でも、GFPで発現をチェックすれば顕微鏡ほぼ全ての細胞で発現しているのを確認できましたし、発現量も非常に高くウェスタンではECL-Plusでディベロッパーにかけるまでもなく茶色いバンドが見られるレベルでした。サッチってる、という印象でしたが、これの10倍というのはあり得るんでしょうか？同一条件化で試して（おおよそ）10倍なんでしょうか？ PYKさんにはクソと言われてしまいましたが、個人的にはFuGene6は気に入っています。最も、使ったのはCHOと293にだから何を使っても入ったのでしょうが。プロモーションで安く大量に手に入ったからというのも理由か。 入りづらい細胞に対しての場合だと、トランスフェクション試薬の変更を試すよりか、（ラボにシステムが揃っているなら）さっさとレンチなりアデノなりに入れ替えた方が結果として早く済むというのが個人的印象としてあります。

jetPRIME 削除/引用 No.6129-9 - 2017/07/18 (火) 14:45:10 - To まだやっていると思うが、フナコシがトランスフェクション試薬のお試しキャンペーンをやっていて、jetPRIMEの試供品をもらった。 293T由来細胞株に対し、今使っているTransIt293とほぼ同等のtransfection効率だった。汎用性もあるようだし、試してみたら？

(無題) 削除/引用 No.6129-8 - 2017/07/18 (火) 11:15:10 - おお 確かにかなり条件にさようされて難しいところはあります。

(無題) 削除/引用 No.6129-7 - 2017/07/18 (火) 10:51:47 - AU リン酸Caとリポフェクション比べたことないですが、そんな感じなんですね。 ただ、下手くそがHEPESのpH合わせると、途端にダメになるという事態に陥ったことあります。

(無題) 削除/引用 No.6129-6 - 2017/07/18 (火) 10:30:31 - おお 293でリン酸カルシウムを使うと、リポフェクションなんかと比べると１０倍ぐらい発現量が高かったりするので、いろいろとメリットがあったりするのです。これだけうまく高発現できる系はなかなかないので。

(無題) 削除/引用 No.6129-5 - 2017/07/18 (火) 09:02:52 - AU たしかに、院生のときはラボが金欠になり、リン酸カルシウムしか使えなくなったことがありましたが、そのときも、Helaや293は、大丈夫でしたね。 教える手間を考えると、まずはFuGeneHDかXtremeにしようかと思います。 自分は、丁寧に教えてもらったので、脂質系も教えた方が良いと思いますが、 リポフェクタミンで細胞死んだけど、入れたベクターの効果か毒性かわかりませんとか、あるでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.6129-4 - 2017/07/18 (火) 02:31:13 - おお ２９３Tなどならリン酸カルシウムを使う人もいますね。PEIでもいいかもしれません。ただし両者は限られた細胞にしか効率のいい導入ができませんね。 Fugene 6はあまり毒性が強くなく結構入る気がしたけど、それ以降のFugeneは使ったことがないです。改善されているとするならより良いのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6129-3 - 2017/07/17 (月) 22:47:38 - AU 返信ありがとうございます。 パッケージだけに使うわけではないですが、 たしかに、293Tのウィルス用トランスフェクションならPEIで大丈夫と伺ったことあります。Addgeneが公開してるパッケージプロトコールもPEIですしね。 パッケージは、293Tとか相当適当にやっても入り、むしろ上清回収まで細胞が元気でいてくれる方が、大事と先輩から聞いたことがります。（本当かな？） パッケージ用には、リポフェクタミンより、effecteneやXtremeHPの方が、良かった印象です。 3T3は、意外と入らなくて私の中でも、2000よりLTXが良かった印象です。 2000で、Primaryも行けたのですね。 院生たち教えて使わせないといけないので、まず、一つラボの標準試薬をと思っています。 べたにリポフェクタミン2000にするか、毒性とか条件検討に手間取ることもあるので、ポリマーorカチオン系にするか迷っていました。 個人的には、Xtremeもまずまずだったですが、FuGeneHDも高評価なんですね。

(無題) 削除/引用 No.6129-2 - 2017/07/17 (月) 22:11:07 - PYK ウイルスのための293TへのTransfectionなら、PEIで十分だと思います。 まだPEIを使用したことがないなら、今後資金が不足することも想定して、一度試してみる価値はあるのでは？ PEI溶液自体は売っていますが、粉末を購入し自作すればほぼタダ同然で半永久的に使えます。 カチオン系の試薬だと細胞内の輸送やオルガネラへの影響も多少あるので、綺麗に細胞内局在を見たい場合、PEIじゃなきゃダメって言う人もたまにいますし。 また、私の周りではFuGene HDは比較的高評価です。（FuGen6はクソですが） Lipofectamine 2000よりも毒性は低いですし、効率もまあまあです。 繊維芽細胞（NIH3T3やMEF）でのtransfectionは、LTXが良い印象があります。 ちなみにウチのラボではPrimary neuronへのtransfectionは、Lipofectamine 2000でいけているようです。 Lipofectamine 3000は私の周りでも低評価です。 他の試薬に関しては私は知りませんので、他の方々の意見は私も聞きたいところです。

トランスフェクション試薬 削除/引用 No.6129-1 - 2017/07/17 (月) 19:57:16 - AU 研究室を移り、新しい研究室でいろんなものがないです。 トランスフェクション試薬を、購入しようかと思っています。 （なかったのが、びっくり） 何買っても良いらしいです（幸い、資金は潤沢らしい）。 どうせなら、新しいイケてるものが良いと思っています。 自分が使用したことのある試薬の感想は、以下です。 Lipo2000（大体、大丈夫だけど、時々全然入らなかったり、毒性出たり） Lipo3000（2000に比べて本当に良いの？、いまいちだった。） LipoLTX（入るやつには2000より、がっつり入るが、駄目なときも） effectene（使うPlasmidが少量でOK、手間は楽、入りやすい細胞なら問題なし） XtremeGene HP（effecteneより、少し汎用性あるかな、毒性で困ったことなし） 要件は、レンチパッケージするので293Tに入る。 そんなのなんでも大丈夫なんだと思いますが、新しいもの買ってもらえるので少しでも良いのが欲しいです。 Primaryの上皮細胞に入ると嬉しい。 （ほとんどレンチだと思いますが、ウィルス使いたくない状況も想定して） 有名どころだと、FuGeneHDとか、使ったことないですが、どうなんでしょう？ 細胞の種類や、条件次第なんですが、未使用製品の感想を聞ければと思います。 エレクトロポレーションは、買うかもですがルーチンにはしないと思うので、今回はなしで。

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