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(無題) 削除/引用 No.6124-8 - 2017/07/18 (火) 13:21:48 - AP Addgeneから入手できるのはsiRNAにせよCRISPRにせよ"Pooled Library"じゃないですか？個々のクローンを個別にそろえたもんじゃなくて、すべてのクローンが混じったものですよね。 これを使う場合、マスでトランスフェクションした細胞群のなかから陽性のものをスクリーンする手段が必要なはずです（FACSからのNGSとか）。こういうスクリーニングストラテジーの論文を最近ちょいちょい目にしますが、あんまり詳しくは知りません。ほかにいい方法、メジャーな方法があるんでしょうか。 それとも、ライブラリーをまいて出てきたコロニーをかたっぱしから拾って、それぞれのプラスミドを個別にトランスフィクションしろとか？

(無題) 削除/引用 No.6124-7 - 2017/07/15 (土) 16:21:45 - mon 現在はshRNAよりCRISPRiが主流かも。 Addgeneよりヒト・マウス用ライブラリーが安価に入手可能です。 もっともほとんどレンチウィルスベクターです。 Addgene HPで、"RNAi library"や"CRISPRi"で検索してください。 以前はクレジットカード払いで支払い（立替え払い）できたけど、現在は住商通さないとダメなのかな？

(無題) 削除/引用 No.6124-6 - 2017/07/15 (土) 15:15:23 - みうみう APさん、monさんご回答ありがとうございます。 私の研究室は、それほどお金がある研究室ではありませんので、できるだけ低コストで行いたいと考えているので、NGSなどを使うのではなく、レポーターアッセイで何とかやってみたいと思います。肝心のshRNAライブラリに関してですが、低コストでかつノックダウン効率もそこそこ良いものがあればいいなと思っているのですが、皆様はどういったものをよく使われているのでしょうか。おすすめのものがあれば、ぜひご教示頂きたく思います。

(無題) 削除/引用 No.6124-5 - 2017/07/15 (土) 13:26:55 - mon 情報の探し方を学ぶ・習得するのも大学院生のうちに済ませておくべきですよ。 あれこれ考えているうちが楽しいです。 実行となると。。。なので、慎重に偵察・戦略・戦術・補給（費用見積・時間）・撤退条件・代替策を考えてください。 ちなみにロボティクスがバイオにも導入されている昨今、資金力があり各種サポートも充実している環境（製薬会社？）なら、数千程度(96 well plate x100枚）なら力業も有りです（あくまでも費用対効果を考慮してですが）。

(無題) 削除/引用 No.6124-4 - 2017/07/15 (土) 13:20:38 - AP siRNAのライブラリが、siRNAそのもののライブラリーではなく、ベクター発現型のsiRNAライブラリーであれば、一括導入してFACSで発現量の低くなっている細胞を濃縮、NGSでそのなかに含まれるベクターの標的配列を読む。

(無題) 削除/引用 No.6124-3 - 2017/07/15 (土) 13:15:49 - AP 遺伝子Xの転写調節領域をつけたリポーター遺伝子を安定導入した細胞株か、 遺伝子Xにリポーター遺伝子をノックインした細胞株を使う。 リポーター遺伝子を発光、蛍光、発色などで検出できるものとし、プレートリーダーで測定する。

(無題) 削除/引用 No.6124-2 - 2017/07/15 (土) 12:41:58 - mon 大学院生なら絶好の勉強チャンスですので、前例を探すなり自分で論理的に考えたりすれば。。 今や、そのようなライブラリーが市販されている便利な世の中なので製品紹介ページも参考になるでしょう。自分でライブラリーを構築するためのvectorを分譲しているAddgeneのHPにも原書論文が紹介されているかも。

shRNAまたはsiRNAを用いたスクリーニング 削除/引用 No.6124-1 - 2017/07/15 (土) 12:32:44 - みうみう 修士大学院生１年のものです。 ある遺伝子X（既知）の発現量を決めている遺伝子Y（未知）を探索するために、shRNAライブラリ（数千遺伝子）を用いて細胞を処理し、遺伝子Xの発現量を減少させた候補遺伝子をとってみたいと考えています。このとき、遺伝子Xの発現量を調べるために、定量的PCRを行ってみたいと思うのですが、ライブラリの遺伝子数を考えると現実的ではないように思うのですが、こういった場合、どういった手法が適切なのでしょうか。

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