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正確な濃度が知りたいなら 削除/引用 No.6122-7 - 2017/07/15 (土) 20:12:00 - 瑯崎 原因の解決にはなりませんが、qPCRのためにできるだけ正確なDNA濃度が 知りたいなら、他の方も言っておられますが、吸光度法以外で定量さてて みては。たとえばサーモフィッシャーのｑｕｂｉｔとか。

(無題) 削除/引用 No.6122-6 - 2017/07/15 (土) 17:06:39 - おお 制限酵素処理した溶液をそのまま使っているならUVに吸収をもつもの（DTTの代わりに入っているやつなど）が入ってたりして相当邪魔しているとか。

(無題) 削除/引用 No.6122-5 - 2017/07/14 (金) 17:05:13 - AP >ホルマリンで固定したサンプルをNacl,proK,RNaseで処理し、エタノール沈殿を行っています。 これじゃ、除タンパク質はできてないはずだし、制限酵素消化してるんならさらに酵素を加えてるわけだしねえ。 吸光度による核酸の定量は、夾雑物の影響を排除して核酸だけを測れるというものではないので、基本的に核酸を単離を目的とした精製をしてからでなければ、意味ないと思います。夾雑物の存在を副波長で予測できるというのもそれが前提でしょう。 夾雑物存在下で正確に測りたかったら、picoGreenなど二本鎖DNA特異的な蛍光色素をかませて蛍光メーターで測定するとか、それなりのやり方があります。 同じ原理でEtBrで染めて蛍光を目視で比色する方法もあります（少なくとも3rd ed.のMolecular Cloningにはでている）。そのサンプルならむしろ、そっちのほうが正確なんじゃないですか？ 簡単便利なnanoDropが出て以来、吸光度測定を過信したり不適切な測定をする人が大量発生しているように思える。

(無題) 削除/引用 No.6122-4 - 2017/07/14 (金) 15:53:27 - ふで おお様 アドバイスから、希釈して測定も行いました。 400ng/ul程度にまで希釈を行いましたが、260/280の値もピークの波形も変わりはありませんでした。 seventh様 260は110程度と非常に高い値が出ています。一方で230、280は20程度で260/280が5.73と異常な値が出ています。

(無題) 削除/引用 No.6122-3 - 2017/07/14 (金) 15:34:31 - seventh 230,260,280,320nmの吸光度はどのくらいでしたか？

(無題) 削除/引用 No.6122-2 - 2017/07/14 (金) 15:04:32 - おお 5522ng/ulってかなり高濃度なので、大抵のこの手の機器では正確に測れていません。なので波形なども正確じゃない可能性が高いと思います。まあNanodropは吸光度計の中でも高い濃度に対応できるようですけど、ちょっと高すぎる気がします。

エタ沈後 260/280の値が高い 削除/引用 No.6122-1 - 2017/07/14 (金) 14:40:34 - ふで いつも参考にさせていただいています。 この度質問させていただくのはエタノール沈殿後のサンプルにおいてナノドロップの260/280の値が高すぎてなおかつ算出された濃度と電気泳動のバンドの濃さが全く一致していない件です。 現在CHIP様の実験で、ホルマリンで固定したサンプルをNacl,proK,RNaseで処理し、エタノール沈殿を行っています。その後、いつものエタ沈とは多少異なる様子のさらさら粉状のペレットを確認し、リンス後、TEに溶解しました。この時点では、制限酵素処理を行ったため、DNAが短くなってサラサラになったという認識をしていました。 その後ナノドロップで濃度を確認すると、260付近に非常に大きなピークを確認することが出来たのですが、5522ng/ulと高濃度のDNAの産出量と共に260/280が5.73と異常に高い値を記録しました(一見は普通のDNAの波形でした)。DNAが断片化していると、大きな値が出ることもあるとの情報から電気泳動を行ってみると、その濃度からは想像できないような非常に薄いバンドしか確認できませんでした。 この後はこのサンプルを用いてq-PCRを行っていく予定ですが、特に影響は及ぼさないものでしょうか？この現象についてご存知いる方、打開策を提案してくださる方いらっしゃたら何でもお願いします。 ps.コンタミにしても260のピークを増大させるようなものは分からず、エタ沈後の白い粉状のペレットはSDSのようにも見えました。SDSが混入しているとこのような値が見られるものでしょうか？

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