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RAW264.7のレトロウィルス感染についてお教え下さい トピック削除
No.612-TOPIC - 2012/06/07 (木) 10:50:13 - Neko
RAW264.7にレトロウィルス（pMSCV）で遺伝子導入を試みていますが、うまくいかずに困っています。エコトロピックエンベロープを持つウィルスを産生し、6-wellプレートにRAW細胞を蒔いて、翌日にウィルス上清を添加し、スピンも行い、翌日にもう一度感染、スピン、培地交換を繰り返して、最初の感染後48時間で評価をしています（蛍光顕微鏡でYFP陽性細胞を確認しています）。ポリブレンも使用しています。培地は、αMEM＋10％FBS＋1％PSを使用しています。以前に同じウィルスでマウスのPrimaryマクロファージに感染を試み、3%前後のYFP陽性細胞を確認できましたが、RAW細胞では全く見られず、RAW細胞への感染の方がPrimaryより難しいのか悩んでいます。どなたかRAW細胞へのレトロウィルス感染をご経験されている方がおられましたら、ぜひご経験をお聞かせ頂ければと思い投稿させて頂きました。宜しくお願い申し上げます。
　
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No.612-7 - 2012/06/08 (金) 11:55:44 - Neko
有難うございました。
レトロネクチンについては全く知りませんでした。かなり良いツールのようですね。また今後使用を検討させて頂こうと思います。

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No.612-6 - 2012/06/08 (金) 10:47:09 - う
レトロネクチンなどの検討も考えに入れるといいと思います。

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No.612-5 - 2012/06/08 (金) 09:47:25 - Neko
お返事有難うございます。
PrimaryとRAWで使用したウィルスのロットは異なっています。ずっと以前に別のベクターでウィルスを産生したときは、10の8乗くらいのタイターでした。同様の方法で今回もウィルスを産生したのですが、タイターは確認していません。ベクターの種類も違いますし、一度タイターも確認してみようと思います。
ところでPubmedでレトロウィルスでRAW細胞に感染させた論文を調べてみますと、ほとんどのPaperでVSVGを含んだウィルスを使用されているようです。私のウィルスはエコトロピックなのですが何かパントロピックでないといけない理由があるのでしょうか？ATCCのRAWの説明では”Abelson murine leukemia virus”にすでに感染させた細胞のようですが、これがエコトロピックではダメな理由にになり得るのでしょうか？もしご存じであればご教示頂ければ大変勉強になります。

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No.612-4 - 2012/06/08 (金) 09:14:12 - ~
ウイルスのタイターは293等で確認されているのでしょうか？

>以前に同じウィルスでマウスのPrimaryマクロファージに感染を試み
これと同じロットであれば、保存中に劣化したかもしれませんし、
違うロットであればタイター自体が分かりませんよね？

タイターの悪いウイルス液であれば、作り直しや濃縮を検討した方が効率がいいかもしれません。

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No.612-3 - 2012/06/07 (木) 22:10:40 - Neko
通りすがり様

有難うございます。RAWはPrimaryより簡単だと思い込んでいたので、1週間での判断というのは大変参考になりました。今の感染細胞をもう少し維持してみようと思います。

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No.612-2 - 2012/06/07 (木) 20:38:49 - 通りすがり
RAWではないですが、似たようなマウスマクロファージでやったことがあります。Primaryよりは効率は落ちますが入るのは入ります。ただ、感染後、48時間ではちょっと厳しいです。確かに、細胞系によっては100％発現するものもありますが、浮遊細胞系では効率もずっと低く、遅い印象があります。一週間くらい待ってから、成功か失敗かは判断していました。

RAW264.7のレトロウィルス感染についてお教え下さい 削除/引用
No.612-1 - 2012/06/07 (木) 10:50:13 - Neko
RAW264.7にレトロウィルス（pMSCV）で遺伝子導入を試みていますが、うまくいかずに困っています。エコトロピックエンベロープを持つウィルスを産生し、6-wellプレートにRAW細胞を蒔いて、翌日にウィルス上清を添加し、スピンも行い、翌日にもう一度感染、スピン、培地交換を繰り返して、最初の感染後48時間で評価をしています（蛍光顕微鏡でYFP陽性細胞を確認しています）。ポリブレンも使用しています。培地は、αMEM＋10％FBS＋1％PSを使用しています。以前に同じウィルスでマウスのPrimaryマクロファージに感染を試み、3%前後のYFP陽性細胞を確認できましたが、RAW細胞では全く見られず、RAW細胞への感染の方がPrimaryより難しいのか悩んでいます。どなたかRAW細胞へのレトロウィルス感染をご経験されている方がおられましたら、ぜひご経験をお聞かせ頂ければと思い投稿させて頂きました。宜しくお願い申し上げます。
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