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考え方がよく分かりました。 削除/引用 No.6116-5 - 2017/07/12 (水) 07:38:12 - KKT TK-1さん 詳細な説明をありがとうございます。 intronやintergenic enhancerの可能性もありそうな遺伝子でしたので、今回のオーバーラップPCRでのクローニングがうまくいかない場合、ご指摘の通り、CRISPRを使う系を考えたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6116-4 - 2017/07/12 (水) 04:47:06 - TK-1 promoterの活性や特異性を見るのならこの方法になりますが、すべての遺伝子でpromoterがその遺伝子の発現に十分ではなく、intronやintergenic enhancerが必要なことがあります。ですので、この方法で出るかはどちらとも言えません。 ただ、あなたがお書きになった方法ではmRNAの5'UTRによる発現調節を無視する系になるので、それよりはマシという程度です。厳密に言えばhomologous recombinationか、あるいはCas9/CRISPRでHDRでコーディングATGにGFPを入れることです。 それに、いくらちゃんとしたコンストラクトを作ってもrandom integrationでtransgenic lineを作った場合はposition effectでendogenous geneの発現と同一になるとは限らないことも考えておいたほうがいいですよ。

ありがとうございます 削除/引用 No.6116-3 - 2017/07/11 (火) 08:49:07 - KKT TK-1さん コメントありがとうございます。 転写開始点まではゲノムDNAで, 以後はcDNAから増幅して翻訳開始点までをクローニングし、翻訳開始点からGFPを発現させるということですね。 この方法は一般的な方法なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6116-2 - 2017/07/11 (火) 00:31:22 - TK-1 転写開始点より上流の約2kbとExon1、Exon2の配列を5'UTRとして入れてみたらどうですか？

転写開始点と翻訳開始点が離れている場合の実験系について 削除/引用 No.6116-1 - 2017/07/10 (月) 22:17:48 - KKT いつも困ったときは助けて頂いてありがとうございます。 zebrafishである遺伝子のpromoter areaをcloningしてGFPにくっつけてtransposon systemを用いてtransgenic fish lineを作製しようと考えています。ところが、ターゲットとなる遺伝子の転写開始点と翻訳開始点の間に開きがあります。 具体的には、翻訳開始点はexon 3からでintron 1, intron 2はそれぞれ15000bp, 20000bpです。この場合、転写開始点より上流の約2-5kbをクローニングし、そのままexon 1の部位にGFPをつなげて翻訳させてもよいものでしょうか？ あるいは、この実験系には無理がありますでしょうか？ 今のところ考えているのは、転写開始点より上流の約2kbをクローニングして、GFPをくっつけたコンストラクトをTol2 vectorに入れる方法です。 コメントや考え方など、宜しくお願い申し上げます。

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