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レトロウイルスによる遺伝子導入　蛋白発現せず トピック削除
No.6108-TOPIC - 2017/07/05 (水) 23:44:55 - 三等兵
いつも参考にさせていただいてありがとうございます。

さて、レトロウイルスによる遺伝子導入についてなのですが、
pMSCVneo vectorのmulti cloning siteに目的遺伝子（ある新規の融合遺伝子で、サイズは3.6k程度）を挿入し、パッケージング細胞はPLAT-Eを用い、BaF3細胞（マウスProB cell)に感染を行いました。
virus stockのtiterは6.2×10E6 copy/μLと十分出ています。
G418によるselection後、BaF3細胞からRT-PCR（当該の新規融合遺伝子のため設計した、junctionをまたぐプライマー）ではしっかり発現を確認できています。
ところが、mRNAレベルでは問題ないと思い、WBを行ったところ、発現が確認できません。C末端(stop codonの直前)にFLAG配列を挿入しており、WBはsigmaのM2 FLAGで行いました。
どこかに途中でstop codonが入るなどないか、念のためシークエンスを再確認しましたが、それもありません。
また、開始コドンの前にKozak配列(GCCACC-ATG--)も挿入しています。

質問は、mRNAレベルで発現しているが、蛋白の発現が確認できない場合、どのような問題があり得るかということです。
別の実験で、FLAGのWBについては容易にできたことはあります。
ウイルスベクターを変えるなど、何か改善点はありますでしょうか？

長文で、わかりにくければ申し訳ありませんが、宜しくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.6108-9 - 2017/07/07 (金) 02:53:22 - おお
>ある新規の融合遺伝子

ガンのTranslocationなどで見つかったようなものかな、、、

(無題) 削除/引用
No.6108-8 - 2017/07/06 (木) 15:28:32 - おお
ちゃんと導入されているのなら、セレクションのまえの感染して２、３日後で調べてみてもいいかもしれません。長期培養で発現量が抑制されていることもあるかもしれませんので。

(無題) 削除/引用
No.6108-7 - 2017/07/06 (木) 15:16:54 - おお
＞ある新規の融合遺伝子
と書いていますが、新規の遺伝子ということで実際のその遺伝子（TransfectionしたExoじゃなくってEndo）のmRNAからTranslationされるということは確認されていますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.6108-6 - 2017/07/06 (木) 13:28:21 - mon
ユビキチン化されてWBではstocking gel上部にいるとか？
また、RT-PCRは、mRNA由来ではなくゲノム上のウィルスゲノム(DNA)配列を増やしているとか？

(無題) 削除/引用
No.6108-5 - 2017/07/06 (木) 11:03:33 - -
Plat-Eにプラスミドをトランスフェクションしてウエスタンで検出したことはありますか？Plat-Eでは過剰発現されるので比較的簡単にウエスタンで検出できるはずです。Plat-Eでも検出できない場合はなにか塩基配列に問題があるんじゃないでしょうか。
また、Plat-Eで検出できてもレトロで入れた細胞では発現が低すぎて検出できないということも時々あります。

(無題) 削除/引用
No.6108-4 - 2017/07/06 (木) 10:31:55 - サンショウウオ

　細胞を固定して免疫染色して見る場合だったら、FLAGタグの配列付近に、バルキーな修飾があると抗体が認識効率が下がることがありますが（タグとタンパク質の間に5〜10残基のリンカーを入れることで対処可能）、

　通常のウェスタンっぽいので、タンパクは変性して直鎖状になってるだろうし問題なく取れそうだけどなぁ。分解されやすいんでしょうか。

　

(無題) 削除/引用
No.6108-3 - 2017/07/06 (木) 06:11:20 - X
その融合遺伝子からは、融合タンパクが発現すると理解してよろしいでしょうか？　であれば、その融合タンパクの予想される細胞内局在に適した、タンパク抽出方法になっているか、確認されてはいかがでしょうか？

G418で選択できていて、mRNA発現も確認されているとの事なので、ウイルスベクターはこのままで良いように思います。気になる点があるとすれば、そのベクターでは目的遺伝子とneo耐性遺伝子の発現がどのようにコントロールされているのか（LTR、他のプロモーター、IRES/P2A、など）ですが、mRNAが確認されており、neo耐性遺伝子だけ発現して目的遺伝子がサイレンシングされている可能性もまず無いようなので、大丈夫なのではないかと思いますよ。

(無題) 削除/引用
No.6108-2 - 2017/07/06 (木) 00:26:42 - w
非常に不安定なタンパク質かもしれませんね。

レトロウイルスによる遺伝子導入　蛋白発現せず 削除/引用
No.6108-1 - 2017/07/05 (水) 23:44:55 - 三等兵
いつも参考にさせていただいてありがとうございます。

さて、レトロウイルスによる遺伝子導入についてなのですが、
pMSCVneo vectorのmulti cloning siteに目的遺伝子（ある新規の融合遺伝子で、サイズは3.6k程度）を挿入し、パッケージング細胞はPLAT-Eを用い、BaF3細胞（マウスProB cell)に感染を行いました。
virus stockのtiterは6.2×10E6 copy/μLと十分出ています。
G418によるselection後、BaF3細胞からRT-PCR（当該の新規融合遺伝子のため設計した、junctionをまたぐプライマー）ではしっかり発現を確認できています。
ところが、mRNAレベルでは問題ないと思い、WBを行ったところ、発現が確認できません。C末端(stop codonの直前)にFLAG配列を挿入しており、WBはsigmaのM2 FLAGで行いました。
どこかに途中でstop codonが入るなどないか、念のためシークエンスを再確認しましたが、それもありません。
また、開始コドンの前にKozak配列(GCCACC-ATG--)も挿入しています。

質問は、mRNAレベルで発現しているが、蛋白の発現が確認できない場合、どのような問題があり得るかということです。
別の実験で、FLAGのWBについては容易にできたことはあります。
ウイルスベクターを変えるなど、何か改善点はありますでしょうか？

長文で、わかりにくければ申し訳ありませんが、宜しくお願いいたします。
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