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(無題) 削除/引用 No.6106-18 - 2017/07/12 (水) 00:29:45 - picotaro その通りです。PfCre4です。なんでもお見通しですね、心強いです！ なるほど！全血をコントロールにするなんて思いつきませんでした。 ありがとうございます。 コントロールのマウスストレインは、WTにするか、実験のコントロールに用いているPfCre +/-にするか悩ましいところですが……。ボスは後者といっていた気がします。 皆様お忙しいところ日になんどもご投稿いただき誠にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6106-17 - 2017/07/11 (火) 23:38:53 - タンパク質 やはり転写因子でしたか。そうだろうとは思っていました。Pf4Creをお使いですかね？ PCRに関して。 PRPを分離する前の全血をインプットとして、それをポジティブコントロールにすればいいでしょうね。その後、PRPでは目的の遺伝子が発現していないことを示せばいいと思います。 1.　WT全血 2.　WTPRP 3.　KO全血 4.　KOPRP 5.　水 くらいでいいのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.6106-16 - 2017/07/11 (火) 17:04:49 - picotaro あとnatureの論文、一般ニュースにもなっていましたね！ 驚きました。

(無題) 削除/引用 No.6106-15 - 2017/07/11 (火) 17:03:39 - picotaro メガカリオサイトよりも未熟なリサーチャーのわたしに皆様こんなにたくさん教えてくださってありがとうございます。消化しきれておらずまとまりのない返信です……。 メガカリョでの核内タンパク質の欠損が血小板にどう影響を与えているかを見るのですよね。 >その通りです！ 血小板で核タンパク質を見るというrationaleがないと思います。 >これはわたしのボスも言っていました。X先生の言うように逆に面白い気もしつつ、実は今回の場合は目的の分子は転写因子なので意味がないのかもしれません。 仰る通り、血小板でKOされていることはわかっても、他の細胞でKOされていないことは示せませんね。どこまでやるか、ということですが、前提を確認する実験なので（超重要と言えば重要ですが）、必要に迫られるまではこの確認にはあまり時間と労力を割きたくないのが正直な気持ちです。（本来どうすべきということは理解していたいですが。）でも骨髄の免疫染色なら他の細胞も見られるので後者も示せますね。 こちらで皆様にお教えいただいたことをもとにボスに相談したところ、血小板のウェスタンは賛成しないがmRNAのPCRはやってみてもよかろうということだったので、まずこれをやってみようかと思います。血小板からRNA十分に取れるのか心配ですが。血小板がそして骨髄の免疫染色もやってみようと思います。そして脾臓なら大変簡単に取れますよね。これもやってみます。 ボスは塗抹の染色と言っていましたが、うちは組織は技師さんが切片にするので、数か月から１年待ちなのでそれで塗抹と言ったんだと思います。逆に言えば骨・骨髄の切片は作れるはずです。（同僚が骨髄標本をすでに頼んでいるそうです。） 結論的には ・血液から血小板を集めてmRNA抽出→PCR ・骨髄か脾臓の標本で免疫染色 が有望そうですね。

(無題) 削除/引用 No.6106-14 - 2017/07/11 (火) 07:33:05 - X あと、言い忘れましたが、骨髄の塗抹標本より、組織切片にした方が良いと思います。ヒト（患者さん）の骨髄塗抹標本の場合は、風乾するだけでまともな標本になりますが、マウスの場合は、血液にせよ骨髄にせよ、塗抹標本を上手に作るにはちょっとコツが必要になると思います。どうしても組織ではなく細胞染色にしたい場合は、スタンプ標本の方がベターだと思いますが、骨髄の場合はちょっと難しいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6106-13 - 2017/07/11 (火) 07:15:44 - X 色々な方からコメントが付いているようで、良かったですね。血小板のRNAについては、網状血小板という幼弱な（できたての）血小板が存在し、RNAを染める染色で検出できます。よって、RNAが無いわけではないのですが、ノックアウト効率を評価するのに十分な量で存在するのか、RTPCR用の内在コントロールをどうするのか、などなど、自分ではやった事がないので何とも言えません。血小板ノックアウトの確認ウエスタンは一時期ルチーンでやっていたので、抗体と発現量が確かならば、問題なくワークすると思います。 骨髄の組織での染色ですが、脱灰のプロセスの経験などあって、骨髄組織票本作成に問題がなければ、選択肢になると思います。巨核球は数としては少ないですが、とても大きな細胞なので、すぐ目に付きますから、結構簡単に見つかります。抗体のクオリティーが問題になるかもしれませんけどね。もし、そのタンパクが、他の骨髄細胞でユビキタスに発現していれば、ある程度巨核球特異的ノックアウトと言える実験になりますね。 核内タンパクを血小板で見る、というのは、どういう発想なのか、ちょっと興味深いと思いました。普通に考えると、巨核球の細胞質から血小板ができてくるので、厳密に核内に局在するタンパクの場合は、血小板で見る意味が無いようにも思うのですが、血小板になる時に核外に移動してくるとか、そういうタンパクであれば（あるのかどうかは知りませんが）、面白いですね。

疑問。 削除/引用 No.6106-12 - 2017/07/11 (火) 05:02:48 - stranger ディスカッションされているやり方だけでは、最初の質問で述べられている目的の、”血小板のみ”でということは、はたせないと思うのですけど、それでOKなのですか？他の部位はわからないが、血小板ではこうだったよということはわかりますが。何か他にすでにデータとかがあるのでしょうか。 ついでに、 https://www.nature.com/nature/journal/v544/n7648/full/nature21706.html

(無題) 削除/引用 No.6106-11 - 2017/07/11 (火) 01:33:35 - タンパク質 メガカリョでしたら骨髄か脾臓でいいのではないでしょうか。 血小板の分離は容易ですよ。PRPを集めればよいだけです。 想像ですが、メガカリョでの核内タンパク質の欠損が血小板にどう影響を与えているかを見るのですよね。 メガカリョでそのタンパク質の発現を免疫染色で見て、血小板ではそのダウンストリームを見るという流れかなと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.6106-10 - 2017/07/11 (火) 01:05:43 - picotaro となりますと、コンディショナルKOマウスである核内蛋白がKOされていることを確認するためには、 血液から遠心分離で血小板を分離して、mRNAを抽出し、PCRで確認する。 骨髄の（骨ごとスライスか塗抹）標本で免疫染色する。 といった方法がまともでしょうか。 しかし後者では、骨髄中に占める割合が0.1％未満ということで視認性に問題があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6106-9 - 2017/07/11 (火) 00:02:40 - タンパク質 可能性はあるとは思いますが、血小板で核タンパク質を見るというrationaleがないと思います。 >[Re:8] picotaroさんは書きました : > ところで、血小板にはmRNAがあり翻訳もされるということですが、核内蛋白も翻訳されるのでしょうか？？？実は見たいのは核内蛋白なのですが……。

(無題) 削除/引用 No.6106-8 - 2017/07/10 (月) 23:35:54 - picotaro ところで、血小板にはmRNAがあり翻訳もされるということですが、核内蛋白も翻訳されるのでしょうか？？？実は見たいのは核内蛋白なのですが……。

(無題) 削除/引用 No.6106-7 - 2017/07/10 (月) 12:02:19 - picotaro ありがとうございます。 こんなにご丁寧に教えていただき感謝申し上げます。 血小板でmRNAからの翻訳もできるのですね、ためている蛋白を放出しているだけかと思っていました。基本的なことも知らずお恥ずかしいです。 ウェスタンならやったことがあるのでできそうです。 血小板の集め方だけ調べればよさそうですね。 Isolation of Primary Megakaryocytes and Studies of Proplatelet Formation by Robert M Levenという文献があるので読み始めていますが、こういうプロトコルって書いてある通りにやってもうまくいかないことがあるので、経験のある方々からのご指導本当にありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.6106-6 - 2017/07/10 (月) 01:04:14 - タンパク質 血小板は核はありませんが、mRNAはありますよ。そしてそれを翻訳する機構も保持しています。 これは昔からよく知られていることです。

(無題) 削除/引用 No.6106-5 - 2017/07/09 (日) 12:23:31 - X 骨髄の巨核球が分離できれば、ゲノムでもmRNAでもタンパクでもできますよ（ゲノムのPCR genotypingが一番簡単と思います）。ただ、巨核球の分離は血小板より大変と思いますので、確認目的だけなら、抗体がワークしている事が分かっていれば、血小板のタンパクでウエスタンするのが、全体の手技としては一番楽な気がします。 血小板の免疫染色は、凝集が起きないように洗浄血小板を準備した上で、フィブリノーゲンなど血小板インテグリンのリガンドでコートしたサーフェスに撒いて接着させて行う事になると思いますが、ちょっと手間がかかるので、あまりオススメしません。 CD61はインテグリンalpha v/beta 3の形で、骨髄の造血幹細胞やマクロファージ系の細胞（破骨細胞含め）に発現している他、好中球や血管内皮細胞でも一部で発現しているようですので、巨核球のソートには向いてないように思います。巨核球は非常に大きいので、培養して増やせば、そのサイズ（FACSのforward/side scatter profile）だけでソートできる（抗体染色なしで）ように思いますが、ソートで壊れてしまう可能性が高いです（巨核球は壊れて血小板になる細胞なので、脆いです）。

(無題) 削除/引用 No.6106-4 - 2017/07/07 (金) 17:46:58 - picotaro 蛋白かmRNAと思っていましたが、そうですね、核がないからmRNAは無理でした……。骨髄からやるならウェスタンということになりますね。先ほどボスからはCD61がどの程度ほかの細胞で陽性になるのか、無視できる量なのか調べなさいと言われました。 末梢血の特殊染色は思いつきませんでした。 もう少し調べて教えて頂いた方法を検討してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6106-3 - 2017/07/06 (木) 05:40:23 - X ノックアウトを証明する方法として、ゲノムレベル、遺伝子発現（RNA）レベル、タンパクレベルでのアプローチがあり得ますが、どの手法を想定されてますでしょうか？　タンパクレベルでよければ、マウス末梢血から血小板を単離して、ウエスタンで見るのが簡単と思います。２段階の遠心でPRPから血小板を落とす方法は確立しており、野生型の血小板からのタンパクをコントロールにしてウエスタンすれば良いと思います。 ゲノムや遺伝子発現レベルだと、巨核球の単離が必要（血小板は無核なので）になります。アルブミン濃度勾配が古典的な方法ですが、骨髄中の巨核球の数自体がかなり少ないので、ちょっと大変かもしれませんね。ソートの場合は、CD61よりCD41の方が特異性が高い（ただし、造血幹細胞、前駆細胞レベルの未熟な細胞でもCD41は出てるかもしれません）と思います。問題は、血小板が付着した白血球がコンタミする可能性（血小板もCD41/CD61陽性）と、ソートで巨核球が壊れてしまう可能性かと思います。可能であれば、骨髄細胞をthrombopoietinで短期間培養し、巨核球を増やしてから分離する方が、アルブミン濃度勾配にせよソートにせよ、扱いやすくなると思います。ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.6106-2 - 2017/07/06 (木) 02:26:54 - w 末血のpltでまず染めてみたら？

マウス血小板の単離 削除/引用 No.6106-1 - 2017/07/05 (水) 20:58:20 - picotaro コンディショナルノックアウトマウスにおいて、血小板のみで目的の分子がノックアウトされていることを示すため、骨髄からメガカリオサイトを単離したいのですが、CD61をマーカーとしてMACSで行う方法では他のさまざまな細胞も拾ってきてしまうようです。一方アルブミン濃度勾配や遠心分離を用いた方法はかなり手間がかかるようです。 マウスの血小板の単離みなさまはご経験がおありですか？

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