BioTechnicalフォーラム [ホルムアルデヒドによるタンパク質架橋後のSDS-PAGEについて]

ホルムアルデヒドによるタンパク質架橋後のSDS-PAGEについて

No.6094-TOPIC - 2017/07/02 (日) 17:26:29 - gin

タンパク質Aと相互作用のあるタンパク質をスクリーニングするための予備実験として、
そもそもタンパク質Aと相互作用するタンパク質が存在しうるのかを検討したいと考えています。実験系として、エピトーグタグを付与したタンパク質Aを発現した細胞に対してホルムアルデヒド処理を行い、SDS-PAGE後ウエスタンブロットを行い、タンパク質Aより大きい分子量のバンドが検出できれば、タンパク質Aと相互作用するタンパク質が存在することを示唆できると考えています。　
この実験系のSDS-PAGEについてですが、ホルムアルデヒドによって架橋されたタンパク質は熱処理や還元剤(DTTや2-ME)によって再び分離してしまうのでしょうか。よろしくお願いします
　

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No.6094-6 - 2017/07/03 (月) 12:33:15 - Tracker

細胞を固定したサンプルの経験はありませんが、組換え精製タンパク(homotrimer)でPFA固定後に泳動するというのはやったことあります。
PFA固定により架橋したのち、SDS-PAGEのサンプルバッファーを添加して70度くらいで5分ボイルした場合にはhomotrimerに相当するバンドが現れますが、95度でボイルしたものだと半分以上がmonomerに解離していました。
なので、ある程度加熱によって架橋は外れるかなと思います。

この70度くらいがいいというのはどこで見たんだったかな。ここだったかな…
少し探してみます。

(無題)

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No.6094-5 - 2017/07/03 (月) 07:58:41 - おお

-CH2-NH-CH2-の結合乖離に必要なエネルギーって、-CH2-CH2-と同じぐらいみたいなのでそうかんたんに外れるものではないと思うけどな。。。もちろんいろいろな反応が起こりうるだろうと想像しているのでそういう反応の中で外れやすいものもあるかと思いますけど。

(無題)

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No.6094-4 - 2017/07/02 (日) 22:09:29 - gin

お二人ともお返事ありがとうございました。
クロスリンクの度合い(Protein-NH-CH2-R-Proteinの数)によって熱安定性が変化するのですかねぇ。　条件検討が必要そうです。

(無題)

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No.6094-3 - 2017/07/02 (日) 20:31:52 - ななし

この論文だと、熱処理で壊れるとしているが、本当に架橋が壊れたのかはわかりません。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=20634879