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(無題) 削除/引用 No.6093-17 - 2017/07/08 (土) 19:18:04 - frozen cells 凍結保存液にもよるとおもいますが、凍結して長期保存したまま（年のオーダー）にしておくと再培養時の生存率が悪くなる事があります。大事な細胞の場合は半年に１度くらい起こして少し増やしてから再度凍結保存してる人も居ます。 生存率が良くない場合、増殖の立ち上がる過程で変なセレクションがかかり、元々は少数派だった一部の細胞集団がドミナントになって、凍結前の実験の再現に影響を与える可能性もときにはありうるとおもいますので一応留意したほがいいです。

(無題) 削除/引用 No.6093-16 - 2017/07/04 (火) 23:52:24 - 駆け出し大学院生 殆ど、解決済みかと思いますが、一応。。。 取り上げられていない点について、何点か。 私も凍結保存細胞の生存率が低く、ごく一部の細胞が接着・増殖しているような印象だと思います。 私も細胞培養を始めて、1年程になりますが、何種類か細胞を扱いました。 -80度での保存では、時々細胞の生存率が極めて低くなります。大体の細胞が大丈夫ですが、私も何種類か経験して、液体窒素保存の細胞で、全然違う生存率が得られてことがあります。 -80度ではやはり半年程で生存率が落ちてくる印象です。 あとオーベンに教わったのが、起こす場合にはFBSの添加を新しくした培地で起こすといいようです。

(無題) 削除/引用 No.6093-15 - 2017/07/04 (火) 18:32:34 - FF ふむふむ様 ご回答ありがとうございます。 確かに、セルリザーバーワンは、プログラムフリーザーやバイセル不要と書いてありました。 もう少し試してみて、経験を積みながら、勉強もしていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.6093-14 - 2017/07/04 (火) 17:25:12 - ふむふむ セルリザーバーって直接−80℃に入れて凍結しても問題ないタイプの保存液ですよね？ それならバイセルは関係ないと思います。 ちなみに私はセルバンカーを使っていますが、直接ディープフリーザーで凍結しても生細胞率が高くておすすめですので、もし今後も上手くいかないことがあるようであれば、セルバンカーに変えてみるのも一つかと まぁセルリザーバーもちゃんとした商品でしょうから、そこが問題とは考えづらいですが・・・ あと考えられるとしたら、商品の期限が切れているとか、何か根本的な手技に手違いがあるかですが、これ以上はとりあえずやってみて、検討するしかないと思いますので、色々ためしてみて何かわかったら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.6093-13 - 2017/07/04 (火) 17:10:49 - FF ふむふむ様 ＞凍結保存液は何を使って、何度で保存してらっしゃるんですか？ ナカライのセルリザーバーワンで-80℃保存です。 ただ1点、大きな問題と思われるのが、バイセルを使っていないところです。 チューブに分注した後、そのまますぐにディープフリーザーに入れています。 分与していただいた方は、この方法で特に問題はないと仰っていましたが、 丁寧に扱うなら、バイセルを使う方がもちろん安全ですので、超高額でもないですし購入を検討しています。

(無題) 削除/引用 No.6093-12 - 2017/07/04 (火) 09:12:19 - ふむふむ >寝かす操作、起こす操作のどちらが悪いかは判断がつかないですかね？ うーん、思いつかないです・・・ ただ個人的な印象としては、起こす操作が原因で細胞が死ぬことは少ない気がします（ちゃんと教科書に従ってやっているのであれば） 凍結保存液は何を使って、何度で保存してらっしゃるんですか？

(無題) 削除/引用 No.6093-11 - 2017/07/03 (月) 20:11:28 - FF poiuy様 LLCの培地はDMEM+10％FBSです。 分与していただいたエッペンにこの培地の記載がありました。 同じLLCでも、型や性質が違うのかもしれませんね。 確かに、増えたからいいかとも思いますが、大丈夫かとの心配もありますね。

(無題) 削除/引用 No.6093-10 - 2017/07/03 (月) 18:32:59 - poiuy ついでの質問ですが 私が某細胞バンクから分与してもらったLLCは推奨培地が10％ FCS DMEMとありましたが、それでは増えず10％ FCS RPMI1640で飼ったら増えました。増えたからいいかと思いつつこれで大丈夫なのかと思うとこがあります。 培地は何ですか?

(無題) 削除/引用 No.6093-9 - 2017/07/03 (月) 17:41:35 - FF mon様 皆様のご指摘の通り、起こし方や寝かし方に問題があるのかもしれません。 確かに、手技の問題の場合は早く改善しないと、多数の細胞を紛失し兼ねないですし、実験に時間がかかるので考え物です。 ふむふむ様 ＞ちなみに生き残った細胞集団はオリジナルの細胞集団と性質が異なってしまっている可能性もあるので、何らかの解析に使用する場合はご注意を。 それが一番気にしているところです。同じ細胞であったとしても、性質が異なっていると正しいアッセイにならないですからね。 ディッシュに撒く前に一部の細胞をトリファンブルーで染めると、どれだけ生きているかはわかりますね。けれど、寝かす操作、起こす操作のどちらが悪いかは判断がつかないですかね？ PD様 ＞ROCK inhibitor(Y-27632) 調べてみます。 とにかく、手技を再確認します。

(無題) 削除/引用 No.6093-8 - 2017/07/03 (月) 15:39:45 - PD 他の方がおっしゃっている通り、保存状態が悪いか凍結融解手技が悪いかで細胞の生存率が著しく低いだけではないでしょうか。数個の細胞のみ接着し、そこから１０日かけて増殖しているのでしょう。そのため、コロニー状に密集して増えているわけです。 普通は必要ありませんが、状態の悪い細胞を起こす時はROCK inhibitor(Y-27632)を入れると、ある程度細胞死は抑えられます。

(無題) 削除/引用 No.6093-7 - 2017/07/03 (月) 15:20:52 - ふむふむ 話を聞く限りですが、凍結手技か解凍手技（またはその両方）、あるいは保存状態が悪くてほとんどの細胞が死んでいたんだと思われます。 培養になれるまでは、解凍してからディッシュにまく前に、一部の細胞をトリパンブルーで染めて、生細胞率を確かめてみたほうがいいかもしれませんね。 ちなみに生き残った細胞集団はオリジナルの細胞集団と性質が異なってしまっている可能性もあるので、何らかの解析に使用する場合はご注意を。

(無題) 削除/引用 No.6093-6 - 2017/07/03 (月) 15:10:37 - mon 1細胞が2細胞に分裂するまで、通常の増殖期に比べ非常に時間がかかる細胞も多いです。細胞間接着(細胞間相互作用？）が細胞増殖に必要なようです。 そのため、最初のうちは生細胞に気づきにくいです。 凍結保存細胞の生存率が悪いなら、保存法（手技？）を改善しないと今後も面倒です。 C3H10T1/2は扱ったことは無いですが、LLCはそんなに厄介な細胞株ではなかったような気がします。

(無題) 削除/引用 No.6093-5 - 2017/07/03 (月) 10:39:24 - FF mon様 mos様と名前を間違えました。大変失礼いたしました。 おお様 ＞Dishについて増えるような細胞はたいてい凍結から起こした翌日か翌々日にはそこに接着して通常の増えている状態に近い形態がしっかりとわかるでしょうし、そういうことがないなら、凍結保存状態が悪かったか起こすときに何か細胞に良くないことをしたかどちらかだと思います。 確かにうまくいった細胞は2〜3日で増殖してくるのですが、今回の場合は"10日経ってから"、また"一部分にのみ密集して"、というところが気になります。 播種してからの顕微鏡観察では、培地の底にざらざらとしたようなものが付いていて、死細胞が浮いている状態が10日間ほど続いて、その後一部分に細胞の増殖が見受けられました。 生き残っていた細胞が増えてくるとしても、密集したというのが気になります。ほんとに極わずかな生き残っている細胞だったので、一部分だったという解釈で良いのでしょうか。 また、C3H10T1/2の方は、同じ時期に寝かしたけれど別ロットのもの2種類で同じ現象が起きているので、やはり寝かし方、起こし方に問題があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6093-4 - 2017/07/03 (月) 08:09:06 - おお >シャーレの一部分に曇りのような点々が現れ、顕微鏡で見ると細胞でした。 生き残っていたコロニーが増えてきたのだと思います。黒いものはおそらく死んだ細胞の塊かと思えますが実際に見てみないと明言できません。 Dishについて増えるような細胞はたいてい凍結から起こした翌日か翌々日にはそこに接着して通常の増えている状態に近い形態がしっかりとわかるでしょうし、そういうことがないなら、凍結保存状態が悪かったか起こすときに何か細胞に良くないことをしたかどちらかだと思います。ただうまく行った細胞もあるようなので、起こすときのプロセスはそんなに問題がないのかもしれません。 いちど増殖させたあと複数の（５本以上とか）凍結保存をしてバックアップを取ったほうが良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.6093-3 - 2017/07/02 (日) 16:37:18 - FF mos様 ご回答ありがとうございます。 ブツブツは培地交換で取り除けます。 黒くまるっこい感じで浮いているので、死細胞かとおもっておりました。 ごく一部の細胞が接着していたとして、10日ほど経って、初めて観察されることはあるのですか？顕微鏡で2日に1回ほどは観察をしているのですが。。 少量過ぎて、見えないのでしょうか？ コラーゲンコートは初めて聞きました。勉強になります。 調べてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6093-2 - 2017/07/02 (日) 16:05:28 - mon 文面からは、凍結保存細胞の生存率が低く、ごく一部の細胞が接着・増殖しているような印象を受けます。 「細胞のようなちいさいブツブツ？のようなもの」は培地交換すると取り除けるますか？取り除けるとすると死細胞だと思われます。Trypan Blueで染色すると生死の判別は容易です。 接着しずらい細胞は、コラーゲンコートしたdish（自作できます）を使うと接着が早まりますので、凍結融解直後にはお薦めです。

細胞培養 削除/引用 No.6093-1 - 2017/07/02 (日) 15:51:44 - FF 細胞培養についてお伺いいたします。 最近、新しく細胞培養を始めました。 私の研究室では、細胞培養を今まで行っておらず、新たに始めたいと思い、手技自体は、1年ほど前に他の研究室の方の教えていただきました。 5月頃から、開始しまして、1つ目の細胞は、問題なく起こし、培養、アッセイまで完了できました。 その後、他の細胞を起こしても、なかなか起きず、顕微鏡観察では、細胞のようなちいさいブツブツ？のようなものがあり、しばらく、培地交換を行いつつ観察をしておりました。 10日間ほどしてから、シャーレの一部分に曇りのような点々が現れ、顕微鏡で見ると細胞でした。 その細胞は、その後密集したまま増殖していった後、継代を行い、新しいシャーレに撒き直すと、シャーレ一面にきれいに増殖しています。 このような細胞が2つあります。C3H10T1/2とLLCです。 細胞により増殖の仕方が違うのは、分かっておりますが、このように起きるのに長期間かかることはありますでしょうか？ 一方は、昨年自分自身で寝かせた細胞、もう一方は10年前に分与してくださった方が寝かせた細胞です。 初めの成功した細胞以外にも別の細胞で培養は出来ておりますので、手技は一通りは出来ていると思います。（細胞によって取り扱い方で注意が特に必要なものもありますが。。基本操作は出来ているかと思います。） 細胞が起きたと考えてよいのか、コンタミなどの別の細胞なのか、判断しかねます。顕微鏡観察では菌のような細かな運動や酵母のような形は見えません。 現在、手技を教えていただいた方が移動され、身近に教えていただく人がおりません。この場で、ご教授いただけますと大変勉強になりますので、ご指導よろしくお願い致します。

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