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DNA沈殿の不要化 トピック削除
No.609-TOPIC - 2012/06/06 (水) 01:13:41 - おやさい
初歩的な質問を失礼します。

プラスミド20ugをSpe Iで切断し、ヒートショックをかけたあとにT4 DNA polymeraseで平滑化後、フェノール・クロロホルム抽出にて精製しました。最後にエタノール沈殿させたペレットを10分静置でエタノールを飛ばして10mM Tris buffer (pH7.9)に溶かそうとすると、まったく沈殿が溶けません。同じ実験を繰り返したところ、全く同じ現象が起こりました。

このような経験は初めてなので、どうしていいか迷っています。
上記の実験過程で、沈殿の不要化に影響しそうなステップがありましたら、教えていただけますでしょうか。また、不要化した沈殿を溶解する方法などもご存知でしたら、合わせて教えていただけたらと思います。

よろしくお願いいたします。
　
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No.609-9 - 2012/06/23 (土) 00:47:33 - おやさい
実験デザインを変更したので、それ以降の検討はしていませんが、皆様がご指摘のようにDNAではなかった可能性が高いとおもいます。
ありがとうございました。

それって 削除/引用
No.609-8 - 2012/06/12 (火) 13:17:00 - 7744
DNAじゃないと思うけど・・・。
ラージプレップした時のカラムのカスとかじゃなくて？

(無題) 削除/引用
No.609-7 - 2012/06/12 (火) 00:21:20 - ふぅ
ま、DNAじゃないんでしょ、それは。
ま、少ないけど泳動するとDNAあるから、とかいいそうだけど、
それは溶けないペレットがDNAであるということではないから。

(無題) 削除/引用
No.609-6 - 2012/06/09 (土) 09:42:35 - qq
プラスミド20ugをそのままフェノール・クロロホルム抽出にて精製し、最後にエタノール沈殿させたペレットを10分静置でエタノールを飛ばして10mM Tris buffer (pH7.9)に溶かそうとすると、溶けませんかね？
つまり、「不溶化したのは本当にDNA？」ということです。
Spe Iで切断し、ヒートショックをかけたあとにT4 DNA polymeraseのところでは、かなり多いたんぱく質（特にBSA）が投入されます。
いかがでしょう？

(無題) 削除/引用
No.609-5 - 2012/06/09 (土) 04:07:21 - おやさい
TEでも上手くいきませんでしたが、EDTAがDNA沈殿の溶解に影響することは知りませんでした。勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.609-4 - 2012/06/06 (水) 07:54:21 - AP
ひょっとしたらですが、EDTAを入れてみたら（つまりTEに溶解する）。Mgと塩を形成しているとDNAは溶けにくくなるからです。
まあ、通常の酵素反応液に入っているくらいのMgで、そこまで溶けにくくなることはあまりないけれど（なんか、普通よりMg濃度が高い条件になっていないか？）。その後の実験でEDTAが邪魔になるようなら、一旦溶かしてからもう一度エタノール沈殿。

(無題) 削除/引用
No.609-3 - 2012/06/06 (水) 07:28:27 - おやさい
不溶化ですね、失礼しました。乾燥はさせすぎないよう注意してます。
80℃で数時間置いても溶けませんでした。その後3日間4℃に置いてますが、全く変化なしです。これだけやれば、乾燥させすぎたRNAでも溶けそうなものですが。沈殿の見た目は核酸なんですが、不思議です。
上清を電気泳動してみたら、かなり薄いながらもDNAを確認出来たので、とりあえずはこれを使って以降の実験を進めようと思ってます。

(無題) 削除/引用
No.609-2 - 2012/06/06 (水) 05:22:43 - (*'へ'*) ﾝｰ
いや、DNA沈殿は要るよ。まあいいや。経験的に知ってると思うけど、エタノール沈殿後に乾かしすぎると溶けなくなって困るわけだが、それとは違う感じ？沈殿の様子とかみてどう。そういうことたまにあるけど時間かければとけてくるけど、そうしても全然だめかな？

DNA沈殿の不要化 削除/引用
No.609-1 - 2012/06/06 (水) 01:13:41 - おやさい
初歩的な質問を失礼します。

プラスミド20ugをSpe Iで切断し、ヒートショックをかけたあとにT4 DNA polymeraseで平滑化後、フェノール・クロロホルム抽出にて精製しました。最後にエタノール沈殿させたペレットを10分静置でエタノールを飛ばして10mM Tris buffer (pH7.9)に溶かそうとすると、まったく沈殿が溶けません。同じ実験を繰り返したところ、全く同じ現象が起こりました。

このような経験は初めてなので、どうしていいか迷っています。
上記の実験過程で、沈殿の不要化に影響しそうなステップがありましたら、教えていただけますでしょうか。また、不要化した沈殿を溶解する方法などもご存知でしたら、合わせて教えていただけたらと思います。

よろしくお願いいたします。
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