>[Re:8] PCRさんは書きました :
> >templateをpositiveコントロールとしてきちんとバンドが出るのに対し、サンプルはバンドが確認できません。
>
> この文章の意味が取れません。
>
> 1）一体何をpositiveコントロールとしたのでしょうか？仰るところの「template」とは？その「template」にどのような操作をしてpositiveコントロールにしたのですか？
>
> 2）サンプルとは？riaさんが作った発現ベクターをtransfectionした細胞のライセートのことでしょうか？
>
> 3）そもそも、そのバンドって何でしょうか？何に対する抗体ですか？その1.5kbpの遺伝子が作るタンパクに対する抗体のはずだとは思うのですが。。。
>
> もう少しきっちりと説明して頂けますか？
>
>
> 初心者のうちは、変な省略をせずにきちんと一つ一つ時系列に沿って（くどいかなと思うくらい細かく）説明した方がいいですよ。でないと色々とミスコミュニケーションがおきますから。
サブクローニングの練習中なのですが、ｐLP/VSVGからMul-VSVG-FとVSVG-Mlu-Rのプライマーを使い、両端にMluTのついたVSVGをPCR（１５サイクル）。PCR産物をアガロースゲル泳動、Gel extraction、PCR-Bluntにligation、transformation、得られたコロニーのうち７つをピックアップ、O/N cultureしminiprep、それぞれをPCI-neoのMluT にligation、colony PCRでインサートの方向を確認した後、正しい向きのコロニーをそれぞれのプレート（VSVG#1~7)からひとつ選びO/N culture、miniprep、その後500ng/eachで12well HEK293にtransfection（Lipo2000、Opti-MEM、4h後にserum入りに交換。PCI-neo-VSVG#1~7、pLP/VSVG（ポジコン）、HEK（ネガコン）すべてPCI-neo-EGFP200ngとcotransfection）。２４時間後EGFP発現を確認し、Harvest、WB。という流れです。
PCR-Blunt-VSVG#1〜7をシークエンシング→少なくとも#2,3はあっていることが分かっています #1,2はシークエンスエラーがありました。#5~7はまだ確認していません。
またPCR-Blunt-VSVGをMluで切ると、1.5Kbp（VSVG)のバンドが確認できます。
しかしWBの結果はポジコンのみVSVGがきれいに見えますが、他はすべてなしです。
上司には配列が間違っているとしか考えられないが、それにしても7つもの違うコロニーからとってきたものが全部だめだとは考えにくいと言われました。
細胞染色、ｍRNAの転写確認等はまだ技術がないためできないです。
開始コドン前後はCGT/ATG/A +4がAとなっています。
限られた情報ばかりですみません。
transfectionはできている、WBの手技も問題ないとすると、
シークエンスエラー、ｍRNAに転写されない、翻訳されないといったことが考えられる、ということであっていますでしょうか？
知りたいのは、なぜうまくいかないのかの原因を見つけていく作業が初めてで、トラブルシューティングしたいのですが調べても分からずここで尋ねさせていただいた次第です。 |
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