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(無題) 削除/引用 No.6083-4 - 2017/06/30 (金) 00:27:28 - フーン あっそ！よかったなw

(無題) 削除/引用 No.6083-3 - 2017/06/29 (木) 22:30:41 - transformation あ、上手くできました！ ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.6083-2 - 2017/06/29 (木) 19:49:50 - 774R 話の前半と後半は全く別の話ですよね？ とりあえず、正しいプラスミドをDH5aで取得していて、それをBL21に入れたけど目的のタンパク質が確認出来ないということですよね？　BL21でコロニーが出るということはtransformationsまでは上手く行ってるはずで、タイトルの「Transformationが上手くいかない」は不適切だと思いますね。 次に、どのような方法でタンパク質の発現を確認したか全く書かれてませんが、精製を試みましたか？　ネガコンはありますか？　ウェスタン等の感度の高い方法でも確認しましたか？ 後半のベクターに欠損の話は分かりかねます。 元のベクターに最初から欠損が入ったものが混じってるとか？ >細かい操作や内容に関してはその都度お答えしていこうと思います。 >宜しくお願いいたします。 教えてもらう人というより、教えてあげる人の言う文言ですよ？それ。

Transformationが上手くいかない 削除/引用 No.6083-1 - 2017/06/29 (木) 18:33:24 - transformation タイトルの通りですがTransformation後、目的のタンパク質の発現が確認できません。 目的の配列をPCR(teqやHiFi、KODでも試してみました)で増幅させた後、InfusionやLigation反応でTransformationさせました。 その際の大腸菌はDH5aです。 その後、インサート前後と内部に変異がないことを確認し、BL21に入れ直してIPTG誘導をかけて目的のタンパク質の発現を確認してみたのですが、それらしきバンドは全く現れませんでした。 さらにですが、[5'-ベクターの配列ーインサートの配列ーベクターの配列-3']という風に想像してください。 この5'のベクター側に毎回同じ変異(欠損)が入ることが多々あり、あたりのクローンを取ってくることも困難です。 ここまでくると正直、自分の操作主義の問題な気もして来たのですが、何かしら心当たりがあるようでしたら教えていただけると幸いです。 細かい操作や内容に関してはその都度お答えしていこうと思います。 宜しくお願いいたします。

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