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(無題) 削除/引用 No.6068-6 - 2017/06/22 (木) 16:20:01 - AP プラクティカルには、それくらいは想定の範囲として、正しい部分を切継したり、in vitro mutagenesisで直したりします。

(無題) 削除/引用 No.6068-5 - 2017/06/22 (木) 08:04:32 - 中年 そういうもの"ばかり"取れてくるのは、欲しいクローンが大腸菌の生育に悪さをするものである場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.6068-4 - 2017/06/22 (木) 06:38:11 - mon exonが飛んだcDNAが取れることは、まま有ります。 cDNAの材料を変えるか、飛んだexonにprimerを設定してcDNAを２分割で増幅＞連結する、飛んだexonを合成する等で対処しています。 変異に関してはSNPsか否かDBで確認して、必要であればPCRで修正しています。

(無題) 削除/引用 No.6068-3 - 2017/06/22 (木) 03:02:51 - ピスケ 回答ありがとうございます。 変異はいつも同じ場所ではないので PCRでまぎれこんできたものかと思われます。 運が悪いことに アミノ酸を変えるnonsynonymousの変異でした。 cDNAのクローニングでアイソフォームで苦労するという話は聞いたことがなかったので 気になって質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.6068-2 - 2017/06/22 (木) 02:05:54 - おお 変異と言いますが、同じところにいつもあるのか、頻度はどのくらいなのか、、、もともとの材料由来の配列を見ているだけではないのか。 Exonが飛ぶのはそういうアイソフォームが発現しているからではないか。 そのような場合は材料を変えるか、あとで修正するか、場合によってはクローン化してプラスミドに入った遺伝子として売られているものを見つけて買うとか、いろいろ考えてみるべきです。 KODは私の感触では意外と変異が入っているのが見つかるような気がしてます。 その変異が入ったといっている配列はアミノ酸配列に影響ありますか？

cDNAクローニング 削除/引用 No.6068-1 - 2017/06/22 (木) 01:22:01 - ピスケ ヒトcDNA由来のPCR産物をクローニングしていますが とれたコロニーをシークエンスしてみますと ・変異が入っている （由来としたcDNA中にはない変異） ・エクソンがとんでいる といったコロニーばかりとれます。 一向に目的としているプラスミドが得られません。 PCRに使った酵素はKOD Plusであり 変異が導入される確率も低いはずです。 cDNAをクローニングする際 変異がはいる、エクソンがとんだものがまぎれてくる ということはよくあることなどでしょうか？ 経験がある方 ぜひお教えください。

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