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ニッケルカラムによるHisタグプロテインの精製 トピック削除
No.6064-TOPIC - 2017/06/21 (水) 01:43:14 - Kenk
今、293細胞でHisタグタンパクを分泌タンパク質として血清のない培地に発現させ、ニッケルカラムで精製しようとしているのですが、2つの問題で困っています。
一つ目は、初めにニッケルカラムに通すと、計算されている吸着よりも圧倒的に少ない量しか吸着されず、多くが素通りに出ます。培地を直接ニッケルカラムに通すのは何か問題があるのでしょうか？無血清培地にキレートとかって含まれているのでしょうか？
2つ目は、ニッケルカラムから溶出後、透析をして、プロテアーゼでHisタグを外します。
その後、プロテアーゼで切断されていないものを取り除くため、もう一度ニッケルカラムに通したのですが、ほとんどが素通りに認められず、切断されているものも吸着しているのが認められています。
目的タンパク質は220アミノ酸でその中に9つのHisが散らばっていますが、こういったものがニッケルカラムに結合することってあるのでしょうか？
よろしくお願いします。

binding buffer: 20mM Tris, pH 7.6, 200mM NaCl
elution buffer: 40mM Tris, pH 7.6, 500mM NaCl, 1M imidazole
　
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No.6064-6 - 2017/06/23 (金) 22:36:38 - Kenk
>[Re:5] monさんは書きました :
> 精製用タグには、38aaとやや長いですが Streptavidin-Binding Peptide (SBP)-Tagがお薦め。目的タンパクが低濃度でもカラムに結合可能（高親和性）で、mildな条件（biotin）で溶出できる（ただし培地成分には注意）。

monさん、

情報ありがとうございます。
ぜひこのタグも検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.6064-5 - 2017/06/22 (木) 19:03:29 - mon
精製用タグには、38aaとやや長いですが Streptavidin-Binding Peptide (SBP)-Tagがお薦め。目的タンパクが低濃度でもカラムに結合可能（高親和性）で、mildな条件（biotin）で溶出できる（ただし培地成分には注意）。

(無題) 削除/引用
No.6064-4 - 2017/06/21 (水) 21:20:26 - Kenk
おおさん、APさん、

教えていただいてありがとうございます。
ニッケルカラムに結合しなかったのが、培地中のアミノ酸などの影響が考えられるとのことで、透析して行いたいと思います。
または別のカラムをはさむことを考えてみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.6064-3 - 2017/06/21 (水) 06:46:14 - AP
Niカラム精製で共存禁忌または濃度に制限がある物質に、アルギニン、グリシン、グルタミン、カルシウムなどが培地に含まれているであろうものも挙げられています。
たとえ個々の物質の濃度が許容範囲だとしても、複合した場合はどうなるかわかりません。また、私の見た資料では上記アミノ酸は許容濃度の表示なくnot recomended となっていました。

(無題) 削除/引用
No.6064-2 - 2017/06/21 (水) 05:39:31 - おお
培地にはいろいろなアミノ酸が入っていて、アミノ基やカルボキシル基がNiカラムとHisストレッチの相互作用を阻害する可能性があります。透析などしたほうが吸着効率がいいかもしれません。

TrisはAcceptableなのですが場合によっては結合を邪魔することがあるようです。リン酸バッファーなどに変えてみるのも手かもしれません。

ニッケルカラムによるHisタグプロテインの精製 削除/引用
No.6064-1 - 2017/06/21 (水) 01:43:14 - Kenk
今、293細胞でHisタグタンパクを分泌タンパク質として血清のない培地に発現させ、ニッケルカラムで精製しようとしているのですが、2つの問題で困っています。
一つ目は、初めにニッケルカラムに通すと、計算されている吸着よりも圧倒的に少ない量しか吸着されず、多くが素通りに出ます。培地を直接ニッケルカラムに通すのは何か問題があるのでしょうか？無血清培地にキレートとかって含まれているのでしょうか？
2つ目は、ニッケルカラムから溶出後、透析をして、プロテアーゼでHisタグを外します。
その後、プロテアーゼで切断されていないものを取り除くため、もう一度ニッケルカラムに通したのですが、ほとんどが素通りに認められず、切断されているものも吸着しているのが認められています。
目的タンパク質は220アミノ酸でその中に9つのHisが散らばっていますが、こういったものがニッケルカラムに結合することってあるのでしょうか？
よろしくお願いします。

binding buffer: 20mM Tris, pH 7.6, 200mM NaCl
elution buffer: 40mM Tris, pH 7.6, 500mM NaCl, 1M imidazole
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