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(無題) 削除/引用 No.6062-22 - 2017/06/22 (木) 16:16:57 - AP >ゲルは７.5パーです。範囲には収まっていると認識しているつもりですが、もしかしたら不適切です。 資料によってあるいはゲルの性能によって異なるけれど、7.5%でセーフなの上限は250 kDほどでしょう。出る出ないの有無判定だけならもっと大きな分子量のタンパク質に使えなくはないとしても、現にサイズを問題にしているのであれば、もっと高分子量側に分画レンジがあるゲル、5%とか4.5%とか使うべきでしょう。とうぜんその範囲の分子量マーカーも付けて。 まあ仮にホモ二量体だとしても二倍の分子量にでるわけじゃないと思いますけど。一方の末端とともう一方の末端で架橋していて二量体が完全な線形になっているのなら別ですが。SDS-PAGEは（核酸の泳動と同様）、分子量というより線形分子の長さと相関しているわけですので。

(無題) 削除/引用 No.6062-21 - 2017/06/22 (木) 11:57:16 - sfree > ダイマーが見れているのなら面白いのかもしれませんが、そういう場合にはモノマーも検出されたりすることも多いでしょうから下手にボイルでアグリゲーションしていないのならそういうことでもなさそうな気がします。 > ただやっぱりちょっと気になりますね。。。 おおさん　コメントありがとうございます。 現段階では、実際ボイルせずも試しましたが、同じでした。ただリン酸及びphの関係でこのタンパク質に電荷の性質が変わるという情報をいただいたので、それの可能性も高いかなとおもいます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6062-20 - 2017/06/22 (木) 03:00:08 - おお タグをつけていたなら、ネガコンで出ないなら大抵は発現したものだといえるのではないでしょうか。内在性のものも同じ挙動を示すということなので、発現の検出はできているのだろうと思えますが、SDSPAGE上で理論的な位置に何がしかの理由で来てないということだろうと推測します。 違う細胞とかでも同じようなサイズに出ますでしょうか？メルカプトエタノールが入っていれば大抵のS-S結合は外れますのでそこはあまり可能性を考えなくてもいいかと思いますが、DTTを使ってみるのは念のためにやってもいいでしょう。 蛋白の移動度はサイズが主なファクターですが蛋白の電荷など他の要因でブレることもありそれがかなり大きいこともたまにあります。電気泳動のバッファーシステムも多様化しているので他のグループの実験と同じような移動度が得られるととも限りません。 発現の確認、発現量を見るということであればその現状でも見れてないわけではありませんからそういう割り切り方もあるかと。 ダイマーが見れているのなら面白いのかもしれませんが、そういう場合にはモノマーも検出されたりすることも多いでしょうから下手にボイルでアグリゲーションしていないのならそういうことでもなさそうな気がします。 ただやっぱりちょっと気になりますね。。。

(無題) 削除/引用 No.6062-19 - 2017/06/21 (水) 15:40:32 - sfree >[Re:17] おおさんは書きました : > https://www.novusbio.com/products/aatk-serine-threonine-protein-kinase-lmtk1-antibody-5b8_h00009625-m03 > この抗体は高いところにバンドが出てますね。 > > http://www.funakoshi.co.jp/contents/189084 > ただ他の抗体はバンドがでてません。なので最初の抗体で検出されている３００kぐらいのバンドはダイマーということではなさそうですね。。。 > > モノクロの5b8を使ってますか？ おおさん　 市販の内在性抗体は使っていません。実験室で精製したラビットのポリクロです。 強制発現でタグ付きのものも見ていましたので、おそらく高いところから出るものはアーティファクトではないように考えています。 各社が出したデータシートには高いところに出たり、予測のところに出たり、更に75kdaという考えづらいところにもあります。先生はともかく本実験室で１０年前からずっと高いところで検出しているため、なぜ違うと追求していませんでした。因みに何故か知らないですが、国外の研究室でも分子量マーカーをつけずに、出しているペッパーが多そうです。このわけもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.6062-18 - 2017/06/21 (水) 15:29:11 - sfree >[Re:16] APさんは書きました : > ちなみに等電点は４付近でこれもかなり偏ってますね。 > 移動度が小さくなる原因にはならないですが。 APさん　分析までいただいて誠にありがとうございます。 頂いたアドバイスを大事にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.6062-17 - 2017/06/21 (水) 15:29:05 - おお https://www.novusbio.com/products/aatk-serine-threonine-protein-kinase-lmtk1-antibody-5b8_h00009625-m03 この抗体は高いところにバンドが出てますね。 http://www.funakoshi.co.jp/contents/189084 ただ他の抗体はバンドがでてません。なので最初の抗体で検出されている３００kぐらいのバンドはダイマーということではなさそうですね。。。 モノクロの5b8を使ってますか？

(無題) 削除/引用 No.6062-16 - 2017/06/21 (水) 15:20:44 - AP ちなみに等電点は４付近でこれもかなり偏ってますね。 移動度が小さくなる原因にはならないですが。

(無題) 削除/引用 No.6062-15 - 2017/06/21 (水) 15:19:16 - AP 膜貫通ドメインはN末付近に一ヶ所だけのようですが、 疎水性アミノ酸の含有率が50％を超えるほどあり、LやPなどがクラスターをなしている領域が散在しているので、疎水結合によるアグリゲーションを起こしやすいと予測できます。 サンプル調製にはボイルを避け、室温〜50℃ほどの穏和な加熱をお試しください。

(無題) 削除/引用 No.6062-14 - 2017/06/21 (水) 15:03:30 - sfree >[Re:12] ぬいさんは書きました : > グリコシダーゼ処理をしてバンドサイズの変化を調べれば、糖鎖修飾の影響がわかると思います。 ぬいさん　情報提供ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6062-13 - 2017/06/21 (水) 15:02:10 - sfree >[Re:11] おおさんは書きました : > >[Re:9] sfreeさんは書きました : > > >[Re:6] おおさんは書きました : > > > ボイルせず、dttを加えるという情報の提供ありがとうございます。 > > リン酸化によってクロスリンクの情報もありがとうございます。 > > リン酸化ではなくってOxidationです > すみません。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6062-12 - 2017/06/21 (水) 14:46:45 - ぬい グリコシダーゼ処理をしてバンドサイズの変化を調べれば、糖鎖修飾の影響がわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.6062-11 - 2017/06/21 (水) 14:09:49 - おお >[Re:9] sfreeさんは書きました : > >[Re:6] おおさんは書きました : > ボイルせず、dttを加えるという情報の提供ありがとうございます。 > リン酸化によってクロスリンクの情報もありがとうございます。 リン酸化ではなくってOxidationです

(無題) 削除/引用 No.6062-10 - 2017/06/21 (水) 12:29:14 - sfree >[Re:7] APさんは書きました : > ちょうど2倍の分子量ったって300 kDaくらいになるんでしょう、ゲルの分画範囲に収まっているのかしら？ でなければ、300でも500でもそれ以上でもおんなじようなところにでて判断つかないんじゃないかな。アグリゲートを見てるんじゃないかという疑いがあります。 > タンパク質名を出せないなら、細胞質性か膜か分泌性かとか、親水性プロファイルとか等電点とか、性質の情報を、 ちょうどというのは私の勝手の可能性が高いです。実質に245kda以上にあるので、それ以上のマーカーが実験室にありません。タンパク質の名前はLMTK１で、膜タンパクです。等電点のこと、思いつきませんでした。確かなphにより極端的に移動の性質が変わるケースがありますよね。ゲルは７.5パーです。範囲には収まっていると認識しているつもりですが、もしかしたら不適切です。

(無題) 削除/引用 No.6062-9 - 2017/06/21 (水) 12:23:48 - sfree >[Re:6] おおさんは書きました : > >脂質修飾や糖修飾全部足してもそんなに150kdaを増やすことは少し考えにくいです > > まずこの認識がどうかなと。。。 > いっそうのことタンパク質の名前を開示すればどうでしょう（できないなら無理にと言いませんけど）。Mucinとか糖修飾で相当大きくなるんじゃないかな。 > > 疎水性の高い蛋白はアグリゲーションによりコバレントではないけどSDSPAGEでモノマーより高いサイズに現れることがあります。この場合はサンプルバッファーを混ぜてからボイルせずに長めのTreatmentをしてPAGEに流すなど工夫することで改善することが多いです。ボイルをしないので２MEのかわりにDTTをくわえるか、追加するかでS-Sの切残りを防いだりもされていると思います。 > > 酸化等によって蛋白がクロスリンクされてコバレントな結合をする場合がまれにあります。 > > またこんなのもあるようです > http://www.pnas.org/content/100/24/14263.full > おおさん、コメントありがとうございます。 指摘されている通り、あまりにも無知識な学生なので、無常識の発言をよくしてしまいます。 タンパク質の名前はLMTK１です。あまりにも無名なタンパク質なので、わざわざ言っても変わらないと思います。 ボイルせず、dttを加えるという情報の提供ありがとうございます。 リン酸化によってクロスリンクの情報もありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.6062-8 - 2017/06/21 (水) 12:17:02 - sfree >[Re:4] monさんは書きました : > SDS-PAGEで分子量相当の位置に流れない単量体タンパクもありますよ。。 > MARCKは332 aa（計算値32kDa)でミリスチン酸化されますが、80kDa付近にバンドが出ます。 monさんコメントありがとうございます。タンパク質がsds-pageでずれることもよくあると知っていますが、あまりにも都合がよく凡そ二倍まで増えるのは少ないと思います（145kda予測実質245kdaよりかなり上に出ています）。今まで読んできた文献ではパルミチン酸及びミリスチン酸でタンパク質においてバンド位置が変わるという情報がないので、貴重な情報提供ありがとうございます。このタンパク質もパルミチン酸化されるので、リン酸化を加え、このようなことになるのも一つの可能性ですよね。

(無題) 削除/引用 No.6062-7 - 2017/06/21 (水) 07:08:41 - AP ちょうど2倍の分子量ったって300 kDaくらいになるんでしょう、ゲルの分画範囲に収まっているのかしら？ でなければ、300でも500でもそれ以上でもおんなじようなところにでて判断つかないんじゃないかな。アグリゲートを見てるんじゃないかという疑いがあります。 タンパク質名を出せないなら、細胞質性か膜か分泌性かとか、親水性プロファイルとか等電点とか、性質の情報を、

(無題) 削除/引用 No.6062-6 - 2017/06/21 (水) 05:33:37 - おお >脂質修飾や糖修飾全部足してもそんなに150kdaを増やすことは少し考えにくいです まずこの認識がどうかなと。。。 いっそうのことタンパク質の名前を開示すればどうでしょう（できないなら無理にと言いませんけど）。Mucinとか糖修飾で相当大きくなるんじゃないかな。 疎水性の高い蛋白はアグリゲーションによりコバレントではないけどSDSPAGEでモノマーより高いサイズに現れることがあります。この場合はサンプルバッファーを混ぜてからボイルせずに長めのTreatmentをしてPAGEに流すなど工夫することで改善することが多いです。ボイルをしないので２MEのかわりにDTTをくわえるか、追加するかでS-Sの切残りを防いだりもされていると思います。 酸化等によって蛋白がクロスリンクされてコバレントな結合をする場合がまれにあります。 またこんなのもあるようです http://www.pnas.org/content/100/24/14263.full

(無題) 削除/引用 No.6062-5 - 2017/06/20 (火) 20:14:39 - 774R 1400aaの分子量の2倍相当と言ったら300kDaですよね？ 泳動条件によっては、単にアグリゲーションしてるのを見てるかもしれませんし、糖鎖付加で実はブロードなサイズなのに分離が悪くてシャープな1本のバンドに見えてるだけかもしれませんし・・・ 何％のゲルでSDS-PAGEしてますか？

(無題) 削除/引用 No.6062-4 - 2017/06/20 (火) 18:05:44 - mon SDS-PAGEで分子量相当の位置に流れない単量体タンパクもありますよ。。 MARCKは332 aa（計算値32kDa)でミリスチン酸化されますが、80kDa付近にバンドが出ます。

(無題) 削除/引用 No.6062-3 - 2017/06/20 (火) 16:46:38 - sfree >[Re:2] みさんは書きました : > ジスルフィド結合以外で二量体になるケースはあると思いますが、 > あなたが検出しているバンドが本当に二量体をとらえているかは証明しないといけません。 > > 一量体の推定分子量の位置には全くバンドが出ないのか。 > 内在性、外来性蛋白ともにそのような挙動を示すのか。 > 抗体の特異性に問題はないのか。 > みさん　ごコメントありがとうございます。 一応タグつきの強制発現したものも、内在性であるものも、タグの抗体あるいはそのものの抗体は全て検出して見ました。25kda以上のところ（このタンパク質は凡そ145kda）を検出しましたが、やはり二倍のところバンド一本しか見えません。

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