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お礼 削除/引用 No.6048-6 - 2017/06/14 (水) 01:27:01 - ENT よくわかりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.6048-5 - 2017/06/13 (火) 09:56:41 - mon まっくろんさんの指摘にもありますが、 一番良いのは、On iceで培地吸引ー＞溶解液投入　です。タンパク回収なら10%TCA添加かな。 培地吸引する時、dishを斜めにして30秒ほどで溜まる培地を再度吸引すればほぼ100%近い培地を吸引できます。ただしクリーンベンチ内で上部から風があたると乾燥するので注意してください（私はクリーンベンチ内で送風無しで作業します）。 なぜなら、余分なシグナルを細胞に入れないためです。トリプシン処理・温PBS洗浄でもシグナル（各種リン酸化）が細胞に入ります。 非常に早いシグナルを検出するのでなければ氷冷した溶液を使えば良いですが、STATシグナルなどは数秒で活性化され有る遺伝子群の転写が始まります。altanative splicing等で制御されている遺伝子(mRNA）も切り替えが起こる可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.6048-4 - 2017/06/13 (火) 09:55:38 - おお どうしてもというならTrypsin inhibitorとかありますけど、、、

(無題) 削除/引用 No.6048-3 - 2017/06/13 (火) 09:54:11 - おお 指摘がすでにありますようにトリプシンを使わずにディシュの上の細胞をPBSなどで剥がさずに洗ってから、PBSをディシュから除きディシュに直接RNA用のLysis Bufferを加えてスクレーパーなどを使って回収すればどうでしょうか？ トリプシンで処理している間にその影響も出るだろうし、血清をstarvationしているのに、血清入りの培地を使うのはどうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.6048-2 - 2017/06/13 (火) 09:42:34 - まっくろん 　中和はした方が良いような気がします。ただ，RNA抽出用と決まっているのであれば，接着したままで洗浄（PBSなど）→溶解液投入（Trizolなど）でも良いのではないでしょうか。

細胞回収時のMediumについて 削除/引用 No.6048-1 - 2017/06/13 (火) 09:09:09 - ENT 研究初心者です。 overnightのstarvationをした培養線維芽細胞をトリプシン処理し、細胞を回収する際のMediumについての質問です。 starvation後なのでDMEMのみで回収するべきか、トリプシンを中和するためにFBS入りDMEMでするべきかどちらがよいでしょうか。 なおRT-PCR目的でその後すぐに遠心、上清除去します。 よろしくお願いいたします。

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