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(無題) 削除/引用 No.6041-8 - 2017/06/12 (月) 12:37:47 - 大腸菌の発現 最終的な実験目標がわからないので，アドバイスの方向性がわかりませんが 単一精製が目標ならば・・・ >そもそも目的のプロテアーゼがバンドとし確認できるかも定かではありません。 タンパク量が十分にあれば，SDS-PAGE/CBB染色で見れるはずです。 とりわけ精製後で，バンドが見れないのは 抽出したタンパク量が不十分なことによると思います。(菌体量を増やす・・・) サンプル濃縮，銀染色を行えば，（モノさえあれば・・・）見えるはずです。 >プロテアーゼ活性染色など 粗抽出であるため，他のプロテアーゼも混入していると思いますので， ザイモグラフィーはやっていた方が無難だと思います。 （基質が最適ならば，CBBに染まらない微量でも検出できる） できれば，ウエスタンブロットも・・・ monさまのアドバイス通り >組換えタンパク発現・精製の方が早いかも。 だとも私は思います。配列がわかっていればですが・・・

(無題) 削除/引用 No.6041-7 - 2017/06/11 (日) 14:41:42 - mon タンパク精製の成書は数多いので、まずは図書館行ったら。。

(無題) 削除/引用 No.6041-6 - 2017/06/11 (日) 14:34:38 - mon 3~5種のクロマトを組み合わせるのが普通かと。 昔は材料調製入れて1~5年がかりとか普通でしたが、培養機器・クロマト機器・カラムの性能が向上したので材料さえ豊富であれば3ヶ月、長くて１年か（お金があれば）。 場合によっては（全ゲノムシークエンス＞）DBサーチ＞遺伝子クローニング（or コドン最適化・遺伝子合成）＞（タグ付き）組換えタンパク発現・精製の方が早いかも。

(無題) 削除/引用 No.6041-3 - 2017/06/10 (土) 12:25:11 - おすし おおさん そうですよね。 クロマトで単一バンドに出来る気がしなくて、、 つい質問してしまいました。 すいません

(無題) 削除/引用 No.6041-2 - 2017/06/10 (土) 12:16:58 - おお >粗酵素液を得ることが出来ました。 粗精製溶液ができた事が何故わかったんですか？その方法でフラクションを見ていけばいいだけの話かと。

酵素精製法 削除/引用 No.6041-1 - 2017/06/10 (土) 11:33:47 - おすし いつもお世話になっております。 グラム陽性菌の膜に局在するプロテアーゼを可溶化し、粗酵素液を得ることが出来ました。 当然のようにSDSーPAGEを行うと複数のバンドが出てしまいます。 イオン交換でバンドを減らそうとしているところですが、そもそも目的のプロテアーゼがバンドとし確認できるかも定かではありません。 今のところプロテアーゼ活性染色などを検討しておりますが 皆さんはどのような方法を試されているのでしょうか。 よろしくお願い致します。

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