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(無題) 削除/引用 No.6033-8 - 2017/06/09 (金) 13:20:05 - 混乱 しまった、途中で投稿してしまいました。 で、この場合、各群3wellでやるのはbiological replicate 各wellをtriplicateでqPCRするのはtechnical replicateのためという認識でした。 が・・・ひょっとして各群3wellでやるのもtechnical replicateなのかな？とは思いはじめています。まぁ表記法の違いだけで、両方複数でやるのは悪いことではない、むしろ誠実なデータの取得法なので、いいことだとは思っています。

(無題) 削除/引用 No.6033-7 - 2017/06/09 (金) 13:15:15 - 混乱 はい、各wellからDNAを抽出し、それぞれのwellをtriplicateでqPCRにかけています。つまり、qPCRにかけているサンプル数は (コントロール3well+　試薬群3well)×3(triplicate)の18サンプルを同時にqPCRにかけています。 で、ここでもう一つの疑問として各wellをn=1と表記してよいのか？というのが悩みです。 検体としては1検体ですので、n=1でしかないと思うのです。 つまりコントロール群、試薬群を各n=3と表記しているのは、ダメなのかな〜と思っています。正しくはtriplicateというべきなんでしょうかね？ DNAをtriplicateで抽出してtriplicateでqPCRを行うっていう、よくわからない表現になってしまいますが・・・・

(無題) 削除/引用 No.6033-6 - 2017/06/09 (金) 12:52:07 - おお では考えないといけないことは、Wellを増やすとか、同じチューブにあるサンプルから３回サンプリングするというのは平均することにより、より正確な値、あるいは分散したサンプル母集団の中の中央値に近い値を得る工夫です。もしWellの間のバラ付きがqPCRによるばらつきより多ければひとつのWellから得られたサンプルにつきcDNAを一回qPCRにかければいいです。ただ、qPCRのばらつきも不安ならひとつのWellから得られたサンプルにつき２回以上qPCRしてもいいです（この場合その平均がそのWellのもっともらしい値ということです）。したがって各Wellの数値を得てn＝３ということにすればTechnical Triplicateとして結果が示せると思います。qPCRの日付もずらす必要もないです。

(無題) 削除/引用 No.6033-5 - 2017/06/09 (金) 11:24:08 - 混乱 あっ、、、すいません 完全に僕の説明不足でした。。。 検体は臨床材料なので、新しくとるってことはできないのです・・・ あくまで一検体のなかで、どこまでやるのかってことでした。

(無題) 削除/引用 No.6033-4 - 2017/06/09 (金) 10:46:04 - おお ちょっとまって、、、 書いてあることをちゃんと把握できてなかったかもしれない。 基本的に可能なら組織からの細胞分離は３回する（もし継代可能で細胞に大きな変化がないなら、P1、P2、P3で三回同じ実験をする。ただしこの場合組織からのプレパレーションによるブレを見てないのでどちらがいいか慎重に）。 このことが基本だと思っています。もちろん臨床材料とかであれば３回同じ人から組織を取ってくるのは不可能なことがありますのでそういう場合はぜんたいのストラテジーを考えないといけないかもしれません。 PCRをいつやって、同じサンプルに対して何回やってと言うのはいかに効率よく正確な（データーとして示せるに耐えうる）結果を得るかということだけで、実験のTriplicateという話とは違います。

(無題) 削除/引用 No.6033-3 - 2017/06/09 (金) 09:10:30 - 混乱 おおさん ご返信ありがとうございます。 継代数による変化がどの程度かは検討しておりません。 しかし、A.Bでやることが重要なのであれば、継代数を合わせることは最低条件ではないかなと思っています。というより、A,Bほど厳密にやるのにもかかわらず、継代数を合わせないというのは、矛盾を感じるという表現が正しいかもしれません。 で、仮に継代数を合わせたと仮定すると、Aと私が最初に示した同日にtriplicateで行う方法にそれほど大きな違いはあるのか？という疑問が出てきます。この２つの方法で異なるのは、実験日だけが違ってきます。その違いを検討する必要はあるのでしょうか？ また、継代数が同じでAまたはBの手法を取るということは、細胞を凍結してストックを作成する必要がでてきます。凍結保存による影響(凍結日数も異なってくる)なども考えると、やはり最初に示したやり方が、各wellもっとも培養条件等が等しいため、適切なのではないか？と判断した次第です。 まぁ、結局は各々のやり方でやればいいんだろうなぁとは思っています。 貴重なご意見をいただき感謝しております。

(無題) 削除/引用 No.6033-2 - 2017/06/09 (金) 05:51:44 - おお >また、株化されていない細胞であれば、継代数を合わせるほうがずっと重要だと 一代変わるだけで劇的に変わる細胞でしょうか？昔の肝細胞のプライマリーはそうでしたけど。ならばそういう細胞のプレパレーションを繰り返すのも手かもしれません。 まあお示しのやり方を見ていたら３代ぐらいは大丈夫みたいですけど。 基本的にはAかBをおすすめします。またはそれぞれのサンプル２ Wellsでやるか。Wellの数が２であればTechnical duplicateだし３ならTechnical triplicate。要するに１ Wellでも測定がぶれが大きくないとか場合によってはサンプルが貴重でできないとかであればそれでよしとすることはあります。１回の測定を測定値とすることはよくありますよね。極端な例は物差しで長さ測ったときとか（もちろん厳密な物理的な実験とかだと複数回図ることはあるかもしれません）。 Cはやっている人もいるかもしれません。いわゆるチャンピオンデーターを載せるみたいなやり方かと。でも三回培養から始めた実験（あなたの表現では別の日の実験）が再現性あるということを示すためにAやBの方法を取るわけです。またAやBで示すことによって実験間でどれくらいのばらつきがあるという情報が示せるわけで、論文を見た人がその情報をもとに３回やるかとか、このばらつきでは自分のやる実験は５回やらないといけないとかそういう判断もできるわけです（理屈としてで、実際どの程度そういう判断をしているかわかりませんけど）。Cでやるなら、１回目、２回目、３回目のグラフをすべて用意し、チャンピオンデーターをしめし、残り２つはsupplementalで示すとかしたほうがいいです。とくに３回の実験を合わせて統計処理をして有意差がでないようであれば、そういうやり方も選択肢だと思います。 しいて加えますと、見えがいいとか悪いとかの問題よりもしっかりと得られた情報がすべて伝えられるかをよく考えたほうがいいです、理想論ですけど。

triplicate?n=3?培養細胞からのqPCR 削除/引用 No.6033-1 - 2017/06/08 (木) 19:17:34 - 混乱 過去にも似たような議論がされているのは存じていますが、今一度、整理するために投稿させていただきました。研究をはじめて間もないため、初歩的な質問になってしまい、申し訳ありませんが、コメントいただきますと幸いです。 組織から分離したある細胞に、薬品を添加して培養した場合の遺伝子発現量の変化を観察するとします。 その時、私は6穴プレートに細胞をまき、3穴分に試薬を添加、残りの3穴分をコントロールとして、RNAを抽出し、qPCRにかけています。 ここでお聞きしたいのが2点あります。 �@　この3穴分のサンプルはtriplicateと表記すべきでしょうか？これをn=3と表記するのは、違和感があります。なぜなら、同じ細胞由来なので、n=1とみなすべきではないか？というのが私の考えです。 �A　標準偏差を出す場合に、私はこのtriplicateの値を用いて出していますが、他のやり方で、再現性等を検討していらっしゃる方はいますか？ 個人的には、他に以下の3つの方法が考えられると思っています。 A.　コントロールと試薬添加を1穴ずつのみ行い、qPCRにかける。これを3回繰り返して得られたデータをtriplicateとして扱う（つまり各群1穴を別々の日にやる）。 つまり例えば　　　DayXのコントロールの値が2 　　　　　　　　　DayYのコントロールの値が3 　　　　　　　　　DayZのコントロールの値が4 　　　　　　　　　DayXの試薬群の値が7　　　 　　　　　　　　　DayYの試薬群の値が8 　　　　　　　　　DayZの試薬群の値が6 これで得られた値、コントロール群（2,3,4）と試薬群(7,8,6)でtriplicateとみなす B.　3穴ずつでコントロールと試薬添加を行い、qPCRにかける。それを別の日に再度行う（計3回）。つまりDayXに3穴ずつ、DayYに3穴ずつ、DayZに3穴ずつ そして各日ごとに、各群の平均値を算出。X,Y,Zのデータ全てでtriplicateとする。 例えばDayXのコントロール群の値が（2,3,4）平均が3 　　　DayYのコントロール群の値が（5,3,4）平均が4 　　　DayZのコントロール群の値が（3,3,3）平均が3 　　　DayXの試薬群の値が（7,9,5）平均が7 　　　DayYの試薬群の値が（10,8,6）平均が8 　　　DayZの試薬群の値が（7,6,5）平均が6 この時コンロトロール群のtriplicateとして扱うデータは、各日の平均値（3,4,3）で、試薬軍のデータは(7,8,6)として扱う。 C.　Bと同じだが、データとして載せるのはDayX,Y,Zのいずれか。 つまり、DayXのみ扱う場合は、コントロール群のデータは（2,3,4）となり、試薬軍のデータは対応する(7,9,5)となる。他の日はあくまで再現性の確認とする。X,Y,Zのどの日のデータを使うかは、再現性があるようであれば、一番ぶれが少なく、グラフが綺麗な（標準偏差の値が小さい、検定でP値が最も小さかった）日のものを主観的に選ぶ という方法が考えられると思います。個人的には株化された細胞株であれば、再現性がある場合に限り、どれでもいいとは思います。おそらくベストなのはBなんだろうとも思います。 しかし、やりすぎな感も否めません。 また、株化されていない細胞であれば、継代数を合わせるほうがずっと重要だと思っていますので、現実的にA,B,Cどれも難しく、最初に述べた手法をとっています。 非常に長くなってしまい、申し訳ありませんが、お聞きしたいことはtriplicateという表記でいいのか？ということと、私の一番最初に述べている手法で問題はないのか？あるならば、こうすべきという手法を教えていただきたい、という質問でした。よろしくお願いします。

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