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MACS（免疫磁器細胞分離）のカラムが詰まる トピック削除
No.6031-TOPIC - 2017/06/08 (木) 16:14:40 - 分離分
組織からCD31陽性細胞をMACSで分離しようとしているのですが、MACSのカラムが途中で詰まってしまうことがあります。

説明書にはカラムをフラッシュするときは、一度完全に流し切ってから、次のバッファーをカラムに入れてフラッシュすることと書いてあります。皆さんも、バッファーでカラムを洗浄して、ポジティブ分離するとき、ちゃんとバッファーを流し切ってから次のバッファーを入れているでしょうか？

個人的にですが、バッファーを完全に流し切ってから、次のバッファーを入れた場合、カラムに空気が入って詰まってしまうのではないかと、考えています。この前一度だけですが、前のバッファーを完全に流し切る前に、次のバッファーを入れたところ、詰まりませんでした。（再現性はまだ確認しておりません）

皆さんの中で、カラムが詰まってしまった経験のある方、また、つまらなくなるようなコツをご存知の方がおりましたら、その手法を教えていただきたいです。

なお、バッファーの脱気は行っております。また細胞はカラムに通す前に、40μのメッシュを通しております。

どうぞよろしくお願いいたします。
　
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No.6031-7 - 2017/12/06 (水) 17:02:15 - 7744
メッシュはどのタイミングで通されているのでしょうか？

メッシュを通すのは、回数よりもタイミングが大事だと思います。

組織の細胞をシングレットにする段階でメッシュを通していても、ビーズのwash後にも結局カス（死細胞の塊？？？）が出てくるので、それまで何回メッシュを通したところで分離直前に通さなければあまり意味が無いかと思います。

もし分離直前に通されているようであれば無視してください。

(無題) 削除/引用
No.6031-6 - 2017/12/05 (火) 14:56:57 - boba
死細胞の除去はしっかり行ってますか？組織からだと死細胞が多いためそれが結合して根詰まりすると思います。dead cell removal kit (cat: 130-090-101)がmacsから出てて同じ操作で除去できます。これを使ってからやれば解決できるかもしれません。
あと、私個人的には流しきってから次のバッファーを加えます。特に今まで問題はありません

(無題) 削除/引用
No.6031-4 - 2017/06/09 (金) 23:41:11 - Tarai
miniMACS（マニュアル）を普段使用しているものです。
分離純度を上げるためbufferは毎回（自然落下で）流しきってから加えていますが、それが原因で詰まったという経験は一度もないです。
組織からの分離だと詰まりやすいことは十分考えられます…可能なら低温で分離するとか、EDTA存在下で分離するとある程度改善されるかもです。メッシュは何回通してもそんなに変わらないですよ。あとは陽性細胞数が多すぎると当然詰まりやすくなります。

(無題) 削除/引用
No.6031-3 - 2017/06/08 (木) 16:36:18 - 分離分
emaさん
説明不足で申し訳ありません、manualMACSでやっております。

やはり組織からのMACSは詰まりやすいんでしょうか・・・
メッシュを通す回数が少なかった（2回）ので、その回数を増やしてみようと思います

目的の細胞が接着細胞なのもカラムに詰まりやすい原因なのかな？とも思っています。

手MACS？AutoMACS? 削除/引用
No.6031-2 - 2017/06/08 (木) 16:23:10 - ema
手MACSは昔、今はAutoMACSで使っています。組織からT,B,NKその他取っていました。
Bufferに関しては私は連続して入れ、流しきったことはないです。普通に使用できていました。
それよりも組織から取ってくるとよく詰まります。
＞また細胞はカラムに通す前に、40μのメッシュを通して
とあるのでやってらっしゃると思いますが、
組織から回収し遠沈管に入れるときにメッシュ（２回かけることもある）→ビーズつけ終わったらメッシュ→少し時間を置くなら直線にメッシュ
と3回４回くらいやってました。
それでも私のサンプルはアグリゲードをおこすこともありました。

MACS（免疫磁器細胞分離）のカラムが詰まる 削除/引用
No.6031-1 - 2017/06/08 (木) 16:14:40 - 分離分
組織からCD31陽性細胞をMACSで分離しようとしているのですが、MACSのカラムが途中で詰まってしまうことがあります。

説明書にはカラムをフラッシュするときは、一度完全に流し切ってから、次のバッファーをカラムに入れてフラッシュすることと書いてあります。皆さんも、バッファーでカラムを洗浄して、ポジティブ分離するとき、ちゃんとバッファーを流し切ってから次のバッファーを入れているでしょうか？

個人的にですが、バッファーを完全に流し切ってから、次のバッファーを入れた場合、カラムに空気が入って詰まってしまうのではないかと、考えています。この前一度だけですが、前のバッファーを完全に流し切る前に、次のバッファーを入れたところ、詰まりませんでした。（再現性はまだ確認しておりません）

皆さんの中で、カラムが詰まってしまった経験のある方、また、つまらなくなるようなコツをご存知の方がおりましたら、その手法を教えていただきたいです。

なお、バッファーの脱気は行っております。また細胞はカラムに通す前に、40μのメッシュを通しております。

どうぞよろしくお願いいたします。
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