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qPCRで目的遺伝子の発現がない群がある トピック削除
No.6030-TOPIC - 2017/06/08 (木) 03:51:45 - もったいないお化け
qPCR法についての質問です。

ある培養細胞にタンパクAを暴露させ、遺伝子BのmRNAの変化を定量しするのが目的です。
コントロール群として設定した、Aを加えない細胞群には、Bの増幅曲線の立ち上がりが全く見られません(40 cycle)。
ですが、Aを加えると早い段階で増幅曲線が立ち上がります。

相対定量法を用いてコントロール群とのCt値の比を計算し、利用しようと考えていたのですが、比べる相手のCt値が出せない状況で、困っています。

この場合、結果をグラフとして示す方法はあるのでしょうか。
絶対定量法(経験はありません)に切り替え、コピー数を算出する、などでしょうか…。

どうぞご教授下さい。
　
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(無題) 削除/引用
No.6030-7 - 2017/06/09 (金) 05:00:33 - おお
>40サイクルでも発現がなかった
->40サイクルでも検出できなかった

(無題) 解決済み 削除/引用
No.6030-6 - 2017/06/08 (木) 22:29:18 - もったいないお化け
どれも大変参考になる意見でした。皆様がおっしゃって下さった通り、数字にこだわらずに、バンドを示し、40サイクルでも発現がなかった旨を記載するのが有効と考えました。
大変お世話になりました。

(無題) 削除/引用
No.6030-5 - 2017/06/08 (木) 12:56:21 - seventh
希釈系列をつくって検量線を書けば、どの程度の濃度まで定量性があるかはわかるので、発現量が刺激群の何分の１以下であるとまでは言えるとは思います。

(無題) 削除/引用
No.6030-4 - 2017/06/08 (木) 09:09:08 - mon
Northen blot等を行わないのであれば、念のためB遺伝子mRNAの別の領域を増幅するプライマーペアでも検証しておくと良いかも。

(無題) 削除/引用
No.6030-3 - 2017/06/08 (木) 05:14:09 - PCR
どうしてもqPCR（およびグラフ）にする必要性がありますかね？それだけ差が大きくてその結果を簡単に示せそうなら、普通のPCR(RT-PCR)をして産物をゲルに流したのを写真に撮ればいいだけのような気がします。加えなかった群は40サイクル回してもバンドがNDだったの一言を添えて。

(無題) 削除/引用
No.6030-2 - 2017/06/08 (木) 04:56:02 - おお
私はこの手の数値の扱い方について実際にそういう問題にぶつかったことはありませんが、発現なし（検出限界以下）、発現していると白黒がはっきりしていることを図として示してもいいのではないかと思います。qPCR後のサンプル（あるいは別個にPCRしてもいいでしょうけど）などを電気泳動して、コントロールではバンドなしを言うのを図にしてFigure legendにサンプルのCt値はいくら、コントロールは４０以上で検出限界以下だったとかく（図にCt値を盛り込んでもいいですけど）などすればいいのではないでしょうか。あるいはqPCRの蛍光を示したグラフを示すか。

どうしても数字がほしいなら、、、Inputの量を上げられないかとか、ここまでやるかという感じはあるけどTotalRNAからRTしてqPCRしているならmRNAを精製するとか（ターゲットがmRNAなら）、どの程度できるかわからないけどCt検出のときの閾値を下げてコントロールでも引っかからないかとか、、、

>絶対定量法(経験はありません)に切り替え、コピー数を算出する
Ct値が出ないとコピー数も求められないと思いますけど。

qPCRで目的遺伝子の発現がない群がある 削除/引用
No.6030-1 - 2017/06/08 (木) 03:51:45 - もったいないお化け
qPCR法についての質問です。

ある培養細胞にタンパクAを暴露させ、遺伝子BのmRNAの変化を定量しするのが目的です。
コントロール群として設定した、Aを加えない細胞群には、Bの増幅曲線の立ち上がりが全く見られません(40 cycle)。
ですが、Aを加えると早い段階で増幅曲線が立ち上がります。

相対定量法を用いてコントロール群とのCt値の比を計算し、利用しようと考えていたのですが、比べる相手のCt値が出せない状況で、困っています。

この場合、結果をグラフとして示す方法はあるのでしょうか。
絶対定量法(経験はありません)に切り替え、コピー数を算出する、などでしょうか…。

どうぞご教授下さい。
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