BioTechnicalフォーラム [Nanodropで量ったの濃度が不安定]

Nanodropで量ったの濃度が不安定

No.6016-TOPIC - 2017/06/04 (日) 22:52:50 - 名無し

細胞からRNAを回収し、そのひの内に、nanodropにより濃度を量りました。
260/280、260/230はそれぞれ2.2-2.16、1.08-1.86でした。
この時計測した濃度をもとにRNA量を計算し、RT-PCRを行い、cDNAを得て、通常のPCRを行いました。その結果、どうもDNA量に差があると考えられたため、再度RNAの濃度を計測したところ、3サンプルのうち、2サンプルで大幅に異なる数値が得られ増した。
但し、260/280、260/230は特に変化していません。
このような事象はよく起こるのでしょうか。
また、原因としてはどのようなことが考えられるでしょうか。
（個人的にはBLANKの水が汚染されていたのでは、考えております。)
どなたかご教示いただければ幸いです。
　

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安定した数値が得られました。

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No.6016-14 - 2017/06/09 (金) 20:37:24 - 名無し

おおさん、APさん
ご丁寧な返答ありがとうございました。
別のサンプルをBufferで10倍希釈した後、3度測ってみると、
安定した数値が連続して得られました。
またトラブルが発生したときはお知恵を貸していただけると幸いです。

(無題)

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No.6016-13 - 2017/06/08 (木) 21:48:06 - 名無し

> RNAの回収方法を明記していなかったことに非があると思うんだけど、書き込みをたどるとどうやらシリカカラムベースの方法でやっているようですね。それだと溶出液を回収するだけだからピンとこなかったかもしれない。
>
すいません。QIAGENのRNeasyというキットを使って回収していました。
事実、ピンときていませんでした。

(無題)

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No.6016-12 - 2017/06/08 (木) 19:34:45 - AP

>RNAを回収直後は均一になりづらいということはあるのでしょうか？

RNAの回収方法を明記していなかったことに非があると思うんだけど、書き込みをたどるとどうやらシリカカラムベースの方法でやっているようですね。それだと溶出液を回収するだけだからピンとこなかったかもしれない。

RNAの精製法はあまたあるの。その多くは最後にアルコール沈殿だとか超遠心の沈殿として回収して水にとかし直すの。これが溶けにくいので均一な溶液にするのが容易でないことがあるの。

(無題)

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No.6016-11 - 2017/06/08 (木) 19:17:57 - 名無し

> 最初にはかったとき溶液が均一でなかったという可能性などないでしょうか？

その可能性も無きにしも非ずなのかな、という気がします。
RNAを回収直後は均一になりづらいということはあるのでしょうか？

(無題)

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No.6016-10 - 2017/06/08 (木) 06:47:32 - おお

>[Re:9] 名無しさんは書きました :
> >[Re:7] おおさんは書きました :
> > 同じ時に２回同じサンプルを測るとどれくらいぶれますか？
> 3回測定してみたのですが、
> 342.33-368.26 ng/ul
> 186.07-198.16 ng/ul
> という感じでした。

まあこのくらいのぶれなら大抵の実用には耐えられますね。
最初にはかったとき溶液が均一でなかったという可能性などないでしょうか？

(無題)

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No.6016-9 - 2017/06/05 (月) 19:52:34 - 名無し

>[Re:7] おおさんは書きました :
> 同じ時に２回同じサンプルを測るとどれくらいぶれますか？
3回測定してみたのですが、
342.33-368.26 ng/ul
186.07-198.16 ng/ul
という感じでした。

(無題)

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No.6016-8 - 2017/06/05 (月) 11:12:27 - AP

希釈した液なら確認のため何回か測り直してみても勿体無くないしね。

(無題)

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No.6016-7 - 2017/06/05 (月) 11:11:07 - おお

ちょっと誤差は大きいと思いますが、250→195 ng/ulこの違いで生じるCtの違いは0．３８ぐらいですよ。量的にはちょっと多いけど、Nanodropなら測れるレンジかなと思います。
指摘にありますようにとくにpHが酸性にふれますとかなり測定値にブレが生じますが、個人的には260/280もその時かなり動きます（減ります）。ただ大抵のRNA抽出キットが精製過程で酸性に振りますので、溶出されたRNA溶液が酸性になっていることは多いと思います。EDTAは２３０で吸収が出ますが、、、バッファーでブランク取ればいいのかなぁ。。。そこはちょっとわかりません。Di-basic potassium phosphate ５mMで希釈して図るといいというプロトコール集を見たことがあります。そこまで気を使うべきなのかはわかりませんけど。

同じ時に２回同じサンプルを測るとどれくらいぶれますか？

(無題)

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No.6016-6 - 2017/06/05 (月) 11:11:05 - AP

逆転写反応はサンプルごとに効率が大きく異なり得るので、RNA量をそろえてもcDNA量はそろわないのが当たり前、っていうくらいの心構えでよろしい。

RNAは十分に溶かしてから測定しているだろうか。溶けきるのに結構時間がかかる。
また、核酸の吸光度は弱塩基性バッファー中でないと正しく測れない。
水に溶かしている RNAそのまま1 uL とって測るのではなく1uL をバッファーで10倍希釈したものを1 uLとって測ったほうがいい。もちろんブランクもバッファーで。

(無題)

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No.6016-4 - 2017/06/05 (月) 10:36:17 - mon

RNAのODを測定するとき、溶媒がDDWだとpHが変動しやすくそのためODも変動するので、TEなどで希釈するのがFAQ。

(無題)

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No.6016-3 - 2017/06/05 (月) 10:35:21 - 名無し

> 実測値どれくらいで、大幅と言うのは数値的にどれくらい差があったのですか？
300→350 ng/ul, 250→195 ng/ul

になりました。これくらいなら、誤差の範囲として良いのでしょうか？

(無題)

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No.6016-2 - 2017/06/05 (月) 00:29:26 - おお

>個人的にはBLANKの水が汚染されていたのでは、考えております。

それはすぐに確認できますよね。あるいはnanodropの検出部が前のサンプルを測ったままきれいにしていなかったとか。

実測値どれくらいで、大幅と言うのは数値的にどれくらい差があったのですか？