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ウイルスベクターで誘導発現 トピック削除
No.6004-TOPIC - 2017/05/30 (火) 20:47:19 - ウイルスベクターで誘導発現
　今、下記のプロメガのレポーターを使っています。
　（NF-κβ応答因子）- luciferase

w3個.promega.jp/-/media/files/resources/protocols/product-information-sheets/a/pgl4-32-luc2p-nf-kb-re-hygro-vector-protocol.pdf


普段トランスフェクションで導入しているのですが、それだと導入できない細胞でアッセイを行うことになり、レトロウイルスベクターで導入することを考えています。

　今使っているベクターにある　（NF-κβ応答因子）- luciferase　を
レトロウイルス用のpMXsベクターに組もこもうと考えています。

(w3個.cosmobio.co.jp/product/detail/01180012.asp?entry_id=4091)

　あまりウイルスベクターを扱ったことがなく、

　最終的に
　LTR−ψ-（NF-κβ応答因子）- luciferase- IRES- puroR-LTR

　のようなコンストラクトを作った場合に、きちんと刺激依存的なルシフェラーゼの発現がなされるか心配です。

　LTRはプロモーターとのことですが、下流のルシフェラーゼを勝手に発現させたりするといったことは起こるのでしょうか。

　お知恵をお貸しいただけると幸いです。

　
　
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(無題) 削除/引用
No.6004-7 - 2017/06/07 (水) 15:20:00 - ウイルスベクターで誘導発現
おお様,mon様

　情報有難うございます。

　SIN型ベクターを購入し、そちらに載せ替えることとなりました。

　IRESは転写されないと活性が無いことを失念しておりました。　危なかったです。

(無題) 削除/引用
No.6004-6 - 2017/05/31 (水) 06:44:45 - おお
http://www.sabiosciences.com/reporter_assay_product/HTML/CLS-5034L.html#resource

このような物があるようです。

(無題) 削除/引用
No.6004-5 - 2017/05/30 (火) 21:40:24 - ウイルスベクターで誘導発現
pMXsベクターの元を当たってみたところ、3'LTRは MMLVというウイルスからもってきているみたいなので、まずエンハンサーが入っているか調べてみます。
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14585362

(無題) 削除/引用
No.6004-4 - 2017/05/30 (火) 21:11:50 - ウイルスベクターで誘導発現
mon 様

　早速回答いただきましてありがとうございます。


　LTRがエンハンサーを含むことについて、不勉強なもので知りませんでした。

　ウイルス発現用のベクターのLTRについてもう少し、論文などで調べてみようと思います。

>ちなみに、ゲノムに組み込まれるときに3'LTRはコピーされて5'LTRと置き換わります。

これも初めて知ったのですが、5'LTRが最終的に消えるのであれば、5'LTRのプロモーター活性を考慮して（NF-κβ応答因子）- luciferaseを逆向きにする必要はないのではと思うのですが。

(無題) 削除/引用
No.6004-3 - 2017/05/30 (火) 20:57:16 - mon
ちなみに、ゲノムに組み込まれるときに3'LTRはコピーされて5'LTRと置き換わります。

(無題) 削除/引用
No.6004-2 - 2017/05/30 (火) 20:54:22 - mon
＞LTRはプロモーターとのことですが、
いえ、エンハンサー+プロモーターです。
そのため、3'LTRがenhancerを欠失したSIN(self-inactivation) typeである必要があります。このときIRES-puroは機能しません。
それでも５’LTRに弱いpromoter活性が有るので、NF-κβ応答因子）- luciferaseが逆向きの方がよいかもしれません。
同様の論文を読んだ記憶がありますので、探してみては。。

ウイルスベクターで誘導発現 削除/引用
No.6004-1 - 2017/05/30 (火) 20:47:19 - ウイルスベクターで誘導発現
　今、下記のプロメガのレポーターを使っています。
　（NF-κβ応答因子）- luciferase

w3個.promega.jp/-/media/files/resources/protocols/product-information-sheets/a/pgl4-32-luc2p-nf-kb-re-hygro-vector-protocol.pdf


普段トランスフェクションで導入しているのですが、それだと導入できない細胞でアッセイを行うことになり、レトロウイルスベクターで導入することを考えています。

　今使っているベクターにある　（NF-κβ応答因子）- luciferase　を
レトロウイルス用のpMXsベクターに組もこもうと考えています。

(w3個.cosmobio.co.jp/product/detail/01180012.asp?entry_id=4091)

　あまりウイルスベクターを扱ったことがなく、

　最終的に
　LTR−ψ-（NF-κβ応答因子）- luciferase- IRES- puroR-LTR

　のようなコンストラクトを作った場合に、きちんと刺激依存的なルシフェラーゼの発現がなされるか心配です。

　LTRはプロモーターとのことですが、下流のルシフェラーゼを勝手に発現させたりするといったことは起こるのでしょうか。

　お知恵をお貸しいただけると幸いです。

　
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