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NGSライブラリの定量でqPCRが安定しない トピック削除
No.6001-TOPIC - 2017/05/27 (土) 16:38:49 - qPCR初心者
NGSライブラリの定量をqPCRで行っているのですが、結果が安定せずに困っています

これまでは、KAPA Library Quantification kitを使用していたのですが、高額なこともあり、TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mixに変更し、KAPAのキットに含まれるスタンダードと、KAPAのキットと同じプライマー配列でライトサイクラー480を使用してqPCRを行っています

PCR反応液はTHUNDERBIRDの標準的な調製で10 ul
PCRサイクル条件はTHUNDERBIRDの標準的な2ステップ＋融解曲線分析
で行っています

症状は
スタンダードが直線に乗らない
増幅曲線が頂点に達した後にすぐにやや下がりそこでプラトーになる
増殖曲線のプラトーがギザギザする
が出たり出なかったりです

また、KAPAのキットに含まれていたプライマーは濃度が公開されていないのですが(10×で使用する仕様)、こちらを使った時と同じ配列を合成したプライマーをプロトコールの濃度で使用した時とでは増幅効率がかなり違い、立ち上がりが5サイクル程度合成プライマーでは遅れてきます

お伺いしたいのは
増殖曲線の異常な状態の原因と改善すべき点
ライブラリ定量の際のプライマーの適正濃度
です

その他何かお気づきの点があればどんな些細なことでも構いませんのでご指摘ください。ライブラリ定量はこうしていますのようなアドバイスも助かります

どうかよろしくお願いします
　
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ありがとうございました 解決済み 削除/引用
No.6001-7 - 2017/06/03 (土) 18:38:37 - qPCR初心者
アドバイスを下さったみなさま、ありがとうございました

その後、無事に解決しました
原因はPCRのサイクル条件でした

＞PCRサイクル条件はTHUNDERBIRDの標準的な2ステップ＋融解曲線分析
で行っています

でしたが、プライマーに変更がない以上、初期変性のステップ以外はKAPAのキットで行っていた時のサイクル条件で行う必要があることを指摘されました

その条件でやり直したところ、スタンダードもサンプルの増幅曲線もきれいにいきました


ありがとうございました

(無題) 削除/引用
No.6001-6 - 2017/05/31 (水) 11:47:27 - かに
連投すみません、
試薬と機械とでreference ROXの条件が合ってないということはないですか？

(無題) 削除/引用
No.6001-5 - 2017/05/31 (水) 11:44:12 - かに
濃度間違いました、各0.3uMでした。

(無題) 削除/引用
No.6001-4 - 2017/05/30 (火) 17:11:40 - -
THUNDERBIRD SYBR Greenと自分で合成したプライマー、KAPAのキットのスタンダーをを使ってqPCRを行い、問題なく使用できています。
プライマーの濃度はTHUNDERBIRDの推奨濃度0.3uMで使用しています。
試薬ではなく、あなたの調製方法にぶれがある可能性は考えられませんか？

(無題) 削除/引用
No.6001-3 - 2017/05/30 (火) 12:56:50 - かに
直接の回答にならないんですけど、KAPAの定量キットで高いのって、スタンダードじゃないですか？
qPCRの試薬は汎用品なので安く（普通のqPCRでも使うので、バルクで買えることもあり）入手できます。
私は、プライマーは合成の物をfinal 各0.6uM入れ、過去に定量したライブラリーを希釈してスタンダードとしてKAPAのqPCR試薬で大雑把な定量としてます。
精製したライブラリーは、KAPAの定量キット使ってもう一度測りますが、これはシークエンスを依頼するのに必要な情報だから省けない、という理由です。

(無題) 削除/引用
No.6001-2 - 2017/05/30 (火) 03:13:42 - おお
ライブラリーの使用している濃度が高すぎるだけということはないでしょうか？希釈して直線に乗るところがあればそこが至適な量という見方はできないですか？

NGSライブラリの定量でqPCRが安定しない 削除/引用
No.6001-1 - 2017/05/27 (土) 16:38:49 - qPCR初心者
NGSライブラリの定量をqPCRで行っているのですが、結果が安定せずに困っています

これまでは、KAPA Library Quantification kitを使用していたのですが、高額なこともあり、TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mixに変更し、KAPAのキットに含まれるスタンダードと、KAPAのキットと同じプライマー配列でライトサイクラー480を使用してqPCRを行っています

PCR反応液はTHUNDERBIRDの標準的な調製で10 ul
PCRサイクル条件はTHUNDERBIRDの標準的な2ステップ＋融解曲線分析
で行っています

症状は
スタンダードが直線に乗らない
増幅曲線が頂点に達した後にすぐにやや下がりそこでプラトーになる
増殖曲線のプラトーがギザギザする
が出たり出なかったりです

また、KAPAのキットに含まれていたプライマーは濃度が公開されていないのですが(10×で使用する仕様)、こちらを使った時と同じ配列を合成したプライマーをプロトコールの濃度で使用した時とでは増幅効率がかなり違い、立ち上がりが5サイクル程度合成プライマーでは遅れてきます

お伺いしたいのは
増殖曲線の異常な状態の原因と改善すべき点
ライブラリ定量の際のプライマーの適正濃度
です

その他何かお気づきの点があればどんな些細なことでも構いませんのでご指摘ください。ライブラリ定量はこうしていますのようなアドバイスも助かります

どうかよろしくお願いします
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