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(無題) 削除/引用 No.5987-17 - 2017/05/30 (火) 15:59:14 - かに エッペンのスイングローターがなくとも、50mlチューブにエッペンをいれて遠心すればよろしい。

(無題) 削除/引用 No.5987-16 - 2017/05/30 (火) 14:03:19 - サンショウウオ アングルローターの遠心機でやると、エッペンが斜めなので、壁面に細胞がよく残って、何回も洗浄すると細胞数が減っていった経験があります。 　スイングローターの遠心機でやると、全ての細胞がチューブのそこに集まるのか、洗浄を繰り返したときの細胞ロスが激減しました。

(無題) 削除/引用 No.5987-15 - 2017/05/27 (土) 01:26:55 - おしる すみません、追記です。 細胞濃度の計算から、最初に取り分けた細胞/GMは200uLです。 GMはChemically definedで生物由来のものは含まれず、添加はサイトカイン数種類のみです。サイトカインの溶解にBSAを用いていますが、終濃度は0.001％程度と思います。 Washに使用したBufferの容量は1mLで、使用時はほぼ室温です。

検証結果 削除/引用 No.5987-14 - 2017/05/27 (土) 01:15:06 - おしる 皆さまありがとうございます。 いただいたアドバイスを元に以下の4群の検討をしました。 １）通常エッペン / PBS ２）通常エッペン / 0.1％BSA/PBS ３）低吸着エッペン / PBS ４）低吸着エッペン / 0.1％BSA/PBS 1x10^5個の細胞をそれぞれのチューブに取り分ける（GM) →500Gx5分（ペレットA) →上清を注意深く吸い取ってそれぞれのバッファを入れる →500Gx5分（ペレットB) →上清を注意深く吸い取ってそれぞれのバッファを入れる →500gx5分（ペレットC） 結果、いずれも最終段階までペレットは認められましたが、１）ではやはり洗う毎にペレットがだんだん小さくなりました。 まったく主観的な印象ですが、ペレットの大きさは１，２，３，４の順に ペレットA：10/10/10/10 ペレットB： 8/ 9/ 9/10 ペレットC： 4/ 6/ 8/ 9 といった印象でした。 結論として、低吸着チューブ・BSAともに有効でした。 BSAの濃度検討はできていませんが、エレクトロポレーションの効率チェックや分化効率のチェックまで考えると条件検討が大変そうなので、今回の結果からは低吸着チューブを採用してしばらく実験をすすめてみようと思います。 遠心時間やGについても細かな設定は都度試してみようと思います。 また以前確認できなかったPBS単独でのペレットが確認できた点については、私の技量のばらつきかもしれませんが、一点思いあたるのは、前回まではペレットを吸引すまいとピペットマンで上清を吸っていましたが、今回は吸引ビンとガラスピペットを用いて上清を除去しました。ペレット目視の元で水面ギリギリをエア半分、メディウム半分で吸う感覚で調整することで、上清除去後のペレットも確認できました。恥をさらすようですが、同じような悩みをお持ちの方がご覧になったときにすこしでも参考になればと思い書かせていただきました。 いずれにしましても、低吸着チューブ、BSA添加など皆さまのアドバイスが大変勉強になりました。 知識の共有という面から、もうしばらくトピックを開けておこうと思います。 さらなるアドバイスやフィードバックをいただければ幸いです。 よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.5987-13 - 2017/05/26 (金) 21:03:56 - mon 使ったことはないけど市販品も有りますね。目的に合うか不明ですが、メーカーに聞いてみても良いかも。 http://www.zenoaq.jp/cellbanker/ja/cellotion.html

皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.5987-12 - 2017/05/26 (金) 19:17:42 - おしる 皆様、アドバイスありがとうございます。 ラボでは孤軍奮闘なので大変心強いです。その後、まだこちらの実験にはとりかかれておりませんが、近日中にご報告いたします。 目標は、血液幹細胞をしっかり遠心ができて、かつエレクトロポレーションの効率・生存率に影響せず、分化を妨げない方法を見つけることですので、これを見失わないように検討を進めたいと思います。 ＞protein様 ありがとうございます。書き洩らしていましたが、遠心のステップは1.5mLのエッペンで行っています。エッペンをスイングで回せる遠心機は周りにないので、BSAをやはり試してみたいと思っております。 ＞MP様 確かにおっしゃる通りかもしれません。ただ同様の実験をしている論文のMethodを繰り返し確認しているのですが、GMにBSAを入れていると書いてあるものが見当たらず、躊躇しています。ただしRecombinantのサイトカインを溶解する際には0.5%BSAを添加しています。こちらは純粋にキャリアとして働いていると考えています。（1000xでいれるので終濃度は無視できる範囲と思っています）また細胞はほとんど浮遊した状態で元気に育っているので、やはり培養時には問題はなさそうに思います。 造血能に影響するという具体的な話は初耳でした。ありがとうございます。勉強いたします。 ＞かに様、乙様 Suggestionありがとうございます。一応、幹細胞を販売している各社のマニュアル、またエレクトロポレーションのマニュアル（Nucleofector, Neon)を見比べても、軒並み室温、200〜300gｘ5〜10分との条件が書かれています（いずれもPBSのステップです）。つまりはもともと機械的ストレスに弱い、もしくは影響されやすい細胞なのではないかと考えいていました（とはいいながら私は習慣で500gｘ5分、4度で行っていますが、これでペレットができないのは既述の通りです）。PBSまでを氷冷して試したことはありませんでした。遠心時間も含めて、やはり実験はやってみないとわからないことが多いと思います。うまい方法にたどり着けたらまたご報告いたします。

(無題) 削除/引用 No.5987-11 - 2017/05/26 (金) 18:21:18 - 乙 PBSはあらかじめ氷冷し、遠心温度も４Cでやってますか。血液系、免疫系の細胞では器壁に接着しやすいものがありますが、これは温度に依存して変わります。

(無題) 削除/引用 No.5987-10 - 2017/05/24 (水) 10:19:30 - かに 単純に、遠心時間を延ばすというのもよくある選択肢ではないかと思います、 30分くらいまで？

(無題) 削除/引用 No.5987-9 - 2017/05/24 (水) 09:54:45 - MP トピの質問内容とはずれるのですが、GMにもBSAをいれたほうがいいのではないでしょうか？細胞自体や添加したサイトカインがプレートに吸着してしまい、悪影響を及ぼす可能性もあるのでは？一般的には１％程度入れているようです。ただし最近の論文でBSAの会社やロットによってHSCの造血能に差が出てくるという報告もあり注意が必要です。分化に関しては影響ないかもしれませんが。 ttp://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(17)30030-9

(無題) 削除/引用 No.5987-8 - 2017/05/24 (水) 01:58:34 - protein 既にアドバイスしている方もおられますが、 PBSだけで洗う必要があるなら、スイング式の遠心機が良いと思います。 やはりペレットは見えにくいと思いますが、あらかじめGMで細胞を遠心してどのあたりに細胞がいるか見ておくといいと思います。 コツは上清をあまりぎりぎりまで取らないことです。キャリーオーバーを減らしたければチューブの容量を小さくしていくといいです。エッペンとか0.6mlに。 横レスですが、自分はBSAは0.5%程度で細胞を洗っていますが、PBSだけに比べて効率よく細胞を集められています。

(無題) 削除/引用 No.5987-7 - 2017/05/24 (水) 01:36:43 - おしる 皆さま、早速のアドバイス誠にありがとうございます。 非常に勉強になります。 最初の投稿の記載がわかりにくく申し訳ありませんでした。 これまでに以下のような検証を行いました。 5x10^5個の血液幹細胞をGrowth mediumのまま2本にとりわけ遠心（500gx5分） →ペレットを確認し上清を除去 →1本には再びGM、1本にはPBSを加えて遠心（500gx5分） →GM：最初と変わらない大きさのペレットを確認、PBS：ペレットを確認できず →PBSのチューブの壁を洗い顕微鏡で確認すると、わずかだが細胞はとれる。 500gを700gまであげて同様のことを行いましたが、やはりPBSでは目視できるペレットはとれませんでした。 GMの方ではずっとペレットがとれるので、細胞が死んでいるとか、ペレットをロスしている可能性はなさそうに思っています。この検証からは、たしかに壁に吸着している分もあるものの、遠心分離自体が難しいように感じています。 追記となってしまいますが、遠心後にエレクトロポレーションを行い血球分化をフォローしたいと思っています。エレクトロポレーションの条件としてCa, Mg不含PBSを用いることも一つの要因かもと考えていますが、これは変更できません。また血清は分化に影響するため添加はなるべく避けたいと思っています。 いただいたアドバイスをもとに、BSAの添加や、低吸着チューブの使用を検討してみたいと思います。 検証結果がでたら再度ご報告いたします。 引き続き、こんな方法もあるよ、というアドバイスがあればぜひぜひお聞かせください。 よろしくお願い申し上げます。 YK様、MP様 BSAを添加される場合にはどのくらいのFinal concで実験しておられるのでしょうか。もしペレットができれば最低濃度を検証していきたいのですが、貴重な細胞で検証にばかり数を割けないので、このあたり、という濃度を参考にお伺いできれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.5987-6 - 2017/05/24 (水) 00:52:47 - YK PBSでは細胞は非常に落ちにくいです。癌細胞のような大きな細胞であれば全く問題ないですが、やはり少量のタンパク質があると、それをキャリアにして、細胞が落ちやすくなることは私も10数年の経験から明らかです。FCSやBSAはとても有効ですね。

(無題) 削除/引用 No.5987-5 - 2017/05/23 (火) 22:47:38 - qq PBSだと透明なので、単に細胞の沈殿が見えにくいということではないのでしょうか？ 直径20umの細胞だとすると、1x10^6で4ul（細胞間隙を考えに入れても10ul以下）ということになるので、そんなに大きいペレットはできないのではないかな。 細胞の見えないチューブを再懸濁してセルカウントすると、細胞が見えたりしないかなあ？

(無題) 削除/引用 No.5987-4 - 2017/05/23 (火) 18:39:05 - MP 低吸着チューブを使うのはどうでしょう？遠心機のローターはスイングでしょうか？GMはRPMIとcytokineのみということですが、BSAなどは入れてませんか？

(無題) 削除/引用 No.5987-3 - 2017/05/23 (火) 13:16:42 - み PBSでは落ちにくいのは確かだね。 もう少しgを上げても良いと思う。 壁にダラダラへばりついていてスタックしてないから無いように見えてるのか、実際に落ちていないのかは見てみないと分からないけど。

(無題) 削除/引用 No.5987-2 - 2017/05/23 (火) 11:48:09 - 0 手技にどの程度の時間をかけていますか？ 細胞自体が死んでいるのでは？

浮遊細胞はPBSで遠心するとペレットができない？ 削除/引用 No.5987-1 - 2017/05/23 (火) 11:27:58 - おしる 初歩的な質問で申し訳ないのですがアドバイスをいただきたくトピックを作成したしました。 最近、血液幹細胞を扱い始めました。 実験に必要な量をエッペンドルフチューブにとりわけて遠心をかける際(500gx5min）、MediumがGrowth mediumだとペレットができるのですが、PBS(-)のときにはペレットができません。 Growth mediumは、RPMI＋いくつかのサイトカインで、血清はいれておりません。 最初、洗浄の過程でペレットを吸っているのかと思ったのですが、かなりスケールアップしても（1x10^6個くらい）、また遠心を700gx5minまであげても、ペレットはできませんでした。 一度コントロールをおいたのですが、 GMで遠心（ペレット有）→上清を吸引（ペレット目視）→GMでSuspendまたはPBSでsuspend とすると、やはりPBSの場合だけペレットができませんでした。 過去のトピックをあたると、浮遊細胞はチューブに吸着しやすいのであらかじめFBSでチューブ表面を洗っておくなどの書き込みも見ましたが、結論はでていませんでした。 その分野の方には初歩的なことのようにも思えるのですが、まわりに聞いても要領を得ず、どなたかよい解決方法などございましたらアドバイスいただきたく存じます。 よろしくお願い申し上げます。

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