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(無題) 削除/引用 No.5981-16 - 2017/05/21 (日) 13:48:36 - 名無し APさん、monさん、おおさん始め、 皆さま方ご丁寧な回答、ありがとうございました。 市販の抗体を使用してWBをするのは初めてでしたので、非常に勉強になりました。 また何か疑問が出た際にも、ご教示いただけるとありがたいです。 とりあえず、HPに掲載されていた細胞株があるかどうか教員に問い合わせてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5981-15 - 2017/05/21 (日) 09:04:30 - mon >[Re:12] 名無しさんは書きました : > ポジコンにあたる試料は目的タンパク質のリコンビナントなどを指すと思う それももちろんポジコンの一つですが、検出感度の検討や細胞内での修飾等も考慮して組織・細胞（抽出液）等がベターです。あるいは先行文献で使われている細胞とか。 > 本来ポジコンは作製するものなのでしょうか？ 目的タンパクの入手が困難で、抗体を自分で作製したとき(抗ペプチド抗体等）は、cDNA発現ベクターを一過性に導入して、その抽出液で抗体の評価をすることも多いです。

(無題) 削除/引用 No.5981-14 - 2017/05/21 (日) 05:01:00 - おお >10分間detectionしてやっと得られたバンドは信頼に足るものなのでしょうか。 必要があればオーバーナイトで検出したりしてます。検出感度は検出用の試薬（キット）でも大きく変わります。またフィルムを使っているかCCDカメラを使っているかでも違います。 いずれにしろちゃんとバンドが出るなら同種の細胞でKOやKDしてみるとたいていわかると思いますが、KDはKDが効いているという前提が必要なのでそこをうまくやれないと余計に混乱するかもしれません。 そのサイズが大きいバンドは現時点ではターゲットの蛋白の可能性もありますし、同じような配列をもつパラログなどの可能性もありますし、ノンスペの場合もあると思います。 Santaに限らずいろいろな抗体のカタログをみて、どのサイズにバンドが検出されているかなど色々見ていくといいかもしれません。 他の会社から抗体をかってそちらのほうが使いやすければそれでもいいと思いますけど、仮に他の抗体でその大きなサイズのバンドがでなくっても、そのバンドが特異的なバンドとして検出されたのかそうでないのかは結論が出ません。アブカムは商品によってはKOを使って特異性を確認した抗体も販売しているようです（だからといってノンスペを絶対に拾わないかと言うとそうとも限りませんけどね）。

(無題) 削除/引用 No.5981-13 - 2017/05/21 (日) 04:29:59 - X SantaCruzの抗体は、あまり使わないのでよく知らないのですが、一般に、市販の抗体のウェブサイトに行くと、その抗体を用いたウエスタンの写真が出てますよね？　その説明文に、どのような細胞のライセートを使ったか書いてあれば（例えば、HeLaとかHEK293Tとか）、その細胞から採ったライセートをポジコンとして使えば良いと思います。 もしポジコンになる細胞株がなければ、そのタンパクをコードする遺伝子をトランスフェクションして用いる事もできます。基本的に、ポジコンは自分で準備するものではないですかね？ １０分で薄いバンドでも、ネガコン（ノックアウトあるいはノックダウンの組織、細胞からのライセート）をきちんを準備して評価した結果であれば、問題ないと思います。ただ、その場合は、もう少し長めにexposeして検出すれば、見やすくなると思います。長めの検出ではノックアウト細胞でもバンドが出るようなら、そのバンドは非特異と判断できますしね。

(無題) 削除/引用 No.5981-12 - 2017/05/20 (土) 21:13:32 - 名無し >Monさん、APさん ご教示有り難うございます。 ポジコンにあたる試料は目的タンパク質のリコンビナントなどを指すと思うのですが、 これは見当違いでしょうか。 ただ、いずれにせよ、ポジコンになるようなタンパク質試料が研究室にはなく、そのため、そういったタンパク質を使ってWBを行ったことは、これまで研究室の誰もないようです。 本来ポジコンは作製するものなのでしょうか？それとも市販のものを購入したり、購入時に付属していたりするものなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5981-11 - 2017/05/20 (土) 20:09:56 - プッ >ポジコンのActin これはひどい・・・

(無題) 削除/引用 No.5981-10 - 2017/05/20 (土) 19:21:25 - AP >一方、目的タンパク質の方は予想位置よりかなり上方に検出され、予測位置には検出されませんでした。 ちゃんとした抗体であっても、タンパク質の性質（電荷の違い、特有の高次構造、修飾など）やアーティファクト（サンプル調製時のアグリゲーションなど）でバンドがシフトすることはあります。 >Santacruz社のこの抗体に問題があるのかどうかを明らかにしたいが、そんなことをするよりも買い直す方が時間的なことを考えると一般的なのか。 タンパク質は千差万別だし、同じタンパク質に対して作られた抗体の性質も千差万別、抗原抗体反応のKd値も千差万別です。力価が低いから、バンドが薄いから、特異性の低い抗体とは限りません。どんな条件でやってもうまくいくような優秀な抗体は市販品であってもほんの一握り。たいていは、それぞれ癖があってそれに応じた条件を工夫しなければならないものです。 ・ブロッキングの条件でバックグランドが低減することもあれば、オーバーブロッキングで検出が出来なくなることもあります。 ・シグナルが弱い（というのは単に他と比べた相対的なもんですね）というだけならエンハンスする方法は数々あるはずです。10分でやっとといいますが、発光試薬の種類にもよるし、場合によってはもっと長い時間かけて検出する場合もあります。 いろいろ試したあげく諦めなければならない抗体もあるけど、それなりに試行錯誤をしたあとの話。そもそも抗体なんてのは試行錯誤のすえに使えるようにするものだと思ってる。

(無題) 削除/引用 No.5981-9 - 2017/05/20 (土) 19:04:19 - AP positive controlというかinternal controlですね。 何を目的として何を評価する実験なのかで変わり得ますが。

(無題) 削除/引用 No.5981-8 - 2017/05/20 (土) 18:26:20 - mon Actinはポジコンではありませんよ。これをポジコンというと混乱します。 ポジコンとは（目的の）抗体で目的タンパクが検出できる試料を指します。

(無題) 削除/引用 No.5981-7 - 2017/05/20 (土) 17:41:02 - 名無し APさん、すいません。 WBを行いました。目的タンパク質に対しては、一次抗体にSantacruz社の500倍希釈した抗体を、ポジコンのActinにはシグマ社の10000倍希釈した抗体を使いました。二次抗体は5000倍希釈した抗mouse抗体を使っています。 DETECTIONの結果、ポジコンのバンドは予測位置に検出されました。 一方、目的タンパク質の方は予想位置よりかなり上方に検出され、予測位置には検出されませんでした。 Santacruz社のこの抗体を以前使ったことのあるラボの人によると、 「過去の論文でSantacruz社のこの抗体が使われていたが、詳しい条件などは記載されていなかった。この抗体を1000倍希釈して、WBを行ったときは、10分間detectionして、やっとうっすら予測位置にバンドが見えた。」 とのことでした。 私の疑問としては、 1.このように比較的低い希釈倍率で抗体を当てて、やっとうっすらと検出されたバンドが果たしてspecificなバンドと言えるのか。もしかすれば、上方にでたバンドの方が目的タンパク質の可能性があるのではないか。 2.Santacruz社のこの抗体に問題があるのかどうかを明らかにしたいが、そんなことをするよりも買い直す方が時間的なことを考えると一般的なのか。 を知りたいと思い、お尋ねしています。 言葉足らずで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.5981-6 - 2017/05/20 (土) 16:36:48 - AP >目的タンパク質とはかなり違う位置にバンドが検出されました。 >記載した通り、ポジコン分子のバンドは予測位置に検出されています。ネガコンのバンドは当然検出されていません。 もう少しスジを整理して書いてくれないだろうか。 何が問題なのか、混乱するわ。

(無題) 削除/引用 No.5981-5 - 2017/05/20 (土) 16:19:40 - み >[Re:1] 名無しさんは書きました : 目的タンパク質とはかなり違う位置にバンドが検出されました。 > (ポジコンにバンドは検出されているので二次抗体などの可能性は低いです。) シグナルの強さはサンプル側の問題や検出試薬の種類で１００倍ー１０００倍変化しても不思議ではないですが、それより分子量が違うことの方が真偽を確かめなければいけないポイントでしょう。 また、ノックダウン、ノックアウトなどで当該バンドが変動するかなど検証する努力をしないといけない。

(無題) 削除/引用 No.5981-4 - 2017/05/20 (土) 16:15:43 - えっ？ >記載した通り、ポジコン分子のバンドは予測位置に検出されています。ネガコンのバンドは当然検出されていません。 どこかに記載されてましたかね？？？？

(無題) 削除/引用 No.5981-3 - 2017/05/20 (土) 15:57:01 - 名無し ラボで共用で使っている抗体なのですが、指導教官曰く 一応、とある論文で使われていたものなのだが、詳しい条件等は掲載されていなかった、とのことでした。 記載した通り、ポジコン分子のバンドは予測位置に検出されています。ネガコンのバンドは当然検出されていません。

(無題) 削除/引用 No.5981-2 - 2017/05/20 (土) 15:42:49 - mon transfer効率やblocking剤、発光試薬の種類、撮影機種の設定（性能）によって、WBの感度は1000倍以上変わるので、postive, negative controlを置かないとなんとも言えません（常識）。 個人的には、Santacruz社の抗体はハズレが多いので、論文・口コミ等で実績がないと信用出来ません。

Western blotting でのノンスぺバンドについて 削除/引用 No.5981-1 - 2017/05/20 (土) 15:15:01 - 名無し Santacruz社の一次抗体を500倍希釈してWBを行ったところ、目的タンパク質とはかなり違う位置にバンドが検出されました。 他の研究室の人によると1000倍希釈して10分間detectionし続ければ、うっすらとバンドが見えたと言うのですが、そのようなバンドが果たして目的タンパク質のものなのか不明です。 (ポジコンにバンドは検出されているので二次抗体などの可能性は低いです。) できればリコンビナントタンパク質を置いてWBをしたいのですが、リコンビナントタンパク質もありません。 そこでお尋ねしたいことは、上記のように10分間detectionしてやっと得られたバンドは信頼に足るものなのでしょうか。 また、このような場合は抗体を変えた方が良いのでしょうか？ 以上、2点教えていただきたいです。

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