KSR様ご連絡頂き、ありがとうございます。
〉引き起こされる細胞死はROCK依存のアノイキスでしょうか。
〉Yの濃度を2〜5倍にしてみる、
〉継代翌日の培地交換の際にもYを足す、最初の培地交換のタイミングを
〉翌々日に変更する等した場合に変化はありますか。
Yの濃度を少しだけ、弄ったこともありますが変化は見られませんでした。
また、培地交換までの日数を1、2日ずらしたとしても通常の培地交換したものとの変化は見られず、播種翌日は接着するのですが2日目以降の死滅は避けられませんでした。細胞死の様子ですが、凍結解凍後翌日の細胞が丸くなって浮いてくるような細胞死とは少し様子が異なり、膜が破れて内容物が出てくるような様子です。
〉乖離液がオリジナルのプロトコルとは違う気がしますが、
〉試しに戻してみてはどうでしょうか。
おっしゃる通り、剥離液を少し変えております。スクレーパーを用いないで綺麗に細胞回収する方法を模索していた時期があり、検討の中で通常のトリプルセレクトよりもこちらのほうが剥離効果が高いこともあり、半年ほど前から変えております。（先月まではこの剥離液を用いており、Aで検証した同じ資材で同僚が行った実験でもこちらの試薬を用いて問題が出ていないことも困惑している要因です）
〉B試しに、継代時の細胞回収操作は同僚が行い、同じ資材を用いて回収され
〉た細胞浮遊液を私が培養皿に播種する所だけ行ったとしても死滅する。
〉（この時の同僚が播種する細胞に問題はない）
私もこの点が、非常に奇妙に感じます。操作者の違いで継代後の細胞の様子が異なることはよく見られることですが、今回に限って同僚との差分を言えば、同僚播種後に自分が播種したため時間が数分違うこと、細胞浮遊液を1000μピペット（エッペンドルフの通常口チップ）で3、4回余分に撹拌されたことぐらいです。その後は同じインキュベータで培養されていたこともあり、死滅しうる要素としてはおよそ考えられにくいと自分では感じております。
細胞にやさしい資材・動きに注目してもう少し検証を重ねてまいりたいと思います。 |
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