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(無題) 削除/引用 No.5974-6 - 2017/05/18 (木) 17:01:21 - 大腸菌の発現 皆さまありがとうございます 理解不足な点が多かったです。 今扱っているタンパクが不溶性にでてきていました。 封入体に含まれていると公に言っていいのか悩み，質問しました。 Triton X-100を試していなかったので，検証しようかと思います。 IPTGさん >不溶性画分と封入体を識別する方法 私もこれが気になるのです qqさん 溶解bufferについては考慮していませんでした。すべきですね。 ミスフォールディングについても思慮が足りなかったです。 おおさん >全ていおいて証明されているわけでもないと思っている。 そこらへん証明しきれてないんでしょうね・・・ 明確に説明されている資料を見つけたことがないです 大腸菌の発現ってできれば，よいみたいな雰囲気があって好きじゃないんですよね monさん 封入体のおおきさについてはあんまり考えていませんでした

(無題) 削除/引用 No.5974-5 - 2017/05/18 (木) 12:21:03 - mon inclusion bodyというと細胞内機能が（積極的に？）関与して細胞内に分散させず集めた電顕等で観察される大きな高密度不溶体（シャペロンも巻き込んでいるイメージ）。 TritonX100不溶性画分というと、大きさ関係なく、生化学的にとにかく高速遠心程度で沈殿画分にとれるもの（inclusion bodyも含む）。 どちらもミスフォールディングが引き金でしょうが、分解系に行けず？残ったモノ。 TritonX100可溶性画分にあっても活性がないものも取れる(ミスフォールディング?)。

(無題) 削除/引用 No.5974-4 - 2017/05/18 (木) 03:17:08 - おお �@封入体と不溶性画分をまったく同一視してはいけない。 それは何を言いたいかによるとおもう。リコンビナントを産生させて不溶性画分にきたならそれが封入体であろうと無かろうと可溶化を試みるのが一般的なアプローチ。そんな状況で区別するのはあまり意味がないかもしれない。 �A膜タンパク質は不溶性画分に回収されても，封入体に含まれてはいない。 膜に入り損ねて封入体などを作ることはあるのでは？ �B封入体とは高発現量のために，分子間の疎水性相互作用により 凝集したものの正体である 実際にタンパク質の発現を弱くしても可溶画分に来ないこともおおいい。もちろん生理的な状況より高発現かどうかという議論は残るかもしれないが、指摘があるようにミスフォールディングが引き金になっていると思われる。ミスフォールディングによる疎水的な部分の露出がアグリゲーションの主要な原因と考えられているといっていいかと思うが、全ていおいて証明されているわけでもないと思っている。

(無題) 削除/引用 No.5974-3 - 2017/05/17 (水) 23:40:11 - qq 不溶性画分って、何に不溶性？ PBSに不溶性 炭酸ナトリウム溶液に不溶性 tritonX100に不溶性 Ureaに不溶性 いろいろあって、それぞれ違う。 私の理解では、tritonX100に不溶性あたりで、根拠なしにinclusion bodyかなと思います。 ＞封入体とは高発現量のために，分子間の疎水性相互作用 高発現が原因とは限らないかもしれないし、分子間の相互作用と考えるよりも分子内のミスフォールドが不溶化の原因だろうと思うね。

(無題) 削除/引用 No.5974-2 - 2017/05/17 (水) 22:52:45 - IPTG 不溶性画分と封入体を識別する方法はあるのでしょうか。というかそれぞれの定義自体も漠然としたものだし、封入体は不溶性画分だし。後者はウィルスなどの封入体からアナロジー的に生まれた言葉では、とも思うけど。

封入体と不溶性画分に関する理解について 削除/引用 No.5974-1 - 2017/05/17 (水) 22:26:49 - 大腸菌の発現 大腸菌発現の際に目的のタンパク質が 不溶性画分に回収されることがありますよね・・・ �@封入体と不溶性画分をまったく同一視してはいけない。 �A膜タンパク質は不溶性画分に回収されても，封入体に含まれてはいない。 �B封入体とは高発現量のために，分子間の疎水性相互作用により 凝集したものの正体である。低温培養，IPTGの削減は相互作用と分子間衝突を減少することで封入体形成を防いでいる。 以上のような理解をしているのですが，大丈夫でしょうか？

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