BioTechnicalフォーラム [大腸菌用にOptimizeされた遺伝子のMammalian cellでの発現]

大腸菌用にOptimizeされた遺伝子のMammalian cellでの発現

No.5961-TOPIC - 2017/05/05 (金) 03:21:49 - ポン太

いつもお世話になっております。
この度Codon usageに関して疑問を抱いたので質問させて頂きます。

現在、レンチウイルスプラスミドのマルチクローニングサイトにRFPを組み込み、HEK293にトランスフェクションをしRFPの発現を見ています。

レンチウイルスプラスミドはSBI社のDual promoter systemのプラスミドを購入しており、構造は次のようになっています。

MSCV promoter---RFP----EF1 promoter---GFP---polyA signal---

（RFPのすぐ直下にEF1 promoterがあります）

Hek293にトランスフェクションしたところ、GFPの発現は確認できるのですが、RFPの発現が全く見えませんでした。

RFPは別の研究室から頂いたものなのですが、Codon usageが大腸菌用に最適化されているようで、mammalian cellで用いられているRFPの配列と異なりました。
mRubyという別のタンパク質も試しましたがこれも見えませんでした。こちらも大腸菌用にOptimizeされています。
Codon usageが違うだけで発現が全く見えなくなるものなのでしょうか。

あるいはDual promoter systemだと一方の遺伝子の発現は見えにくくなるのでしょうか。商品として発売されているのでその可能性は低いと思いますが。

どなたかご助言してくださると幸いです。
どうぞ宜しくお願い致します。
　

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大腸菌用にOptimizeされた遺伝子のMammalian cellでの発現

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No.5961-12 - 2017/05/07 (日) 09:42:11 - ポン太

皆様、貴重なご意見有難うございます。
大変勉強になります。
とりあえず、コドンが大腸菌用に最適化されているのはあまり問題ではなく、プロモーターやPolyAの方に問題がありそうですね。
通りすがりさんの仰っているベクターも販売されていましたので検討してみます。
有難うございました！

(無題)

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No.5961-11 - 2017/05/06 (土) 16:40:47 - おお

GFPのあとにPolyAがあるのでそこまで伸びることによって安定性が担保できるというのはこういうウイルスベクターではよくありますね。私が使っていたレンチ用の結構古いタイプのベクターもプラスミドで発現させるとLTR、その後に現れるプロモーター、下流のプロモーター三種類から同じ共通のPolyAまでのmRNAができる非常に多岐にわたるRNAができるものをつかってました（もしかしたらLTRの前にプロモーターがあったかもしれない）

(無題)

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No.5961-10 - 2017/05/06 (土) 15:46:14 - mon

＞なぜpolyAを入れるとウイルスの産生が悪くなるのかわからない
GFP--polyAのPolyAは3'LTR内に有るのでしょう。そのため、その前にpolyA siteがあると(3'LTRがないため）パッケージングされないmRNAが増えるからでしょう。

MSCV promoterからGFP--polyAまで転写はされるものも多いと思いますが、EF1 promoter領域はGC richなので（？）不完全な転写終結が起こるかもしれません。もしかするとGC richなpromoterはbi-directionalなことも多いのでEF1 promoterからの逆向き転写が起きて(二本鎖RNAが生じて）翻訳阻害が生じているかも。。

(無題)

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No.5961-9 - 2017/05/06 (土) 15:42:15 - 通りすがり

>会社の学術の方にきいたところPolyA　SignalをRFP直下にいれるとレンチウイルスの
>産生が少なくなるからやめたほうが良い、とのことでした。

LTRからウイルス核酸を転写する時にRFP直下のpolyAで止まってしまうためですね。
回避策として、polyA-RFP-MSCV promoter-EF1 promoter---GFP---polyA signal
と逆向きにすれば良いと思います。

(無題)

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No.5961-8 - 2017/05/06 (土) 13:20:02 - toto

プロモーターの奪い合いも多少はあるでしょうけど、PolyAがないことが主な原因のほうに、一票。これではRFPのmRNAの安定性がかなり悪くなるでしょう。ただ、この場合は、2－3日すると光るのが見えてくるかもしれませんが、強いGFPシグナルとかぶって弱いRFPのシグナルは見えないかもしれない。
　なぜpolyAを入れるとウイルスの産生が悪くなるのかわからないですが、メーカーの話は、ユーザーから聞いた話をつないだだけのこともあるので、参考程度にきいといて、自分で試した方が良いです。

(無題)

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No.5961-7 - 2017/05/06 (土) 09:47:32 - おお

あ、プロモーター同士のコンペティションは起こっている可能性はご指摘のとおりですね。

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No.5961-6 - 2017/05/06 (土) 00:50:07 - ポン太

皆様有難うございます。

5'Sequenceは
MSCV promoter---Kozak sequence--ATG(RFP)---
としております。

実は同じ会社から別のレンチウイルスプラスミドを購入しておりまして、こちらは
Single promoterでMSCVの直下にGFPがあります。
こちらをトランスフェクションしますと、GFPの発現が見えます。

会社の学術の方にきいたところPolyA　SignalをRFP直下にいれるとレンチウイルスの産生が少なくなるからやめたほうが良い、とのことでした。
ただ、会社の方もMSCVはHek293で発現が弱いと仰っていました。
MSCVおよびEF1が近傍にあるので、両者が競合してMSCV側の発現が弱くなっているのかもしれません。

昔、異なるプロモーター（CMVとSV40だったはず）を持つ2種類のプラスミドをHela細胞にCo-transfectionしたところ、一方のプラスミドの発現が非常に低くなることがありました。一方だけだと発現しました。
ポリメラーゼの取り合いが起こっているのかもしれません。

(無題)

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No.5961-5 - 2017/05/05 (金) 23:21:48 - 通りすがり

RFPのすぐ直下にもpolyAが必要なのでは?
RFPのmRNAが少ないために蛍光が見えなくなっていると思います。

(無題)

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No.5961-4 - 2017/05/05 (金) 16:33:24 - おお

The MSCV promoter was also active in HEK 293T cells (Fig. 1C)
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0051015
こちらでは発現が見られてますね。。。

(無題)

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No.5961-3 - 2017/05/05 (金) 11:36:59 - mon

MSCV promoterって、HEK293で弱い発現しかしないのでは。。

(無題)

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No.5961-2 - 2017/05/05 (金) 08:17:28 - おお

最初のメチオニンが認識されてるかな。。。RFPなんかすごい安定で強い蛍光を持ってるので全然見れないっているのはなんか違う原因のような気がしないでもない。。。

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No.5961-1 - 2017/05/05 (金) 03:21:49 - ポン太

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