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ウェスタンのバンドが上のほうに出ます トピック削除
No.5954-TOPIC - 2017/05/01 (月) 18:27:18 - みゃーご
いつも拝読しており、とても勉強になります。

購入したORFを用いてC末端にFlagがつくようなconstructを作製し、制限酵素でinsert確認、PCRで方向確認、シーケンスで配列確認をしました。

transientに細胞にtransfectionしてウェスタンブロッティングしたのですが、想定が30kDaなのに対し、実際にバンドが出たのはマーカーの一番上のバンドより上でした。なんならほとんど泳動が出来ない状況です(controlサンプルにはそういったシグナルが見られないので恐らくFlagのシグナルだと思います）。

考えられることとして
@aggrigateしてる
A膜タンパクなので修飾を受けてる
かなと思って、@の可能性を排除するため超音波でよく破砕してWBしましたがやはり同じ症状になりました。
vectorを入れ替えても同じようになります。
Aという可能性もなくはないですが、修飾でそんなに流れないほどになるものでしょうか？

ちなみにターゲット遺伝子自体の抗体をメーカーHPで見ると普通に30kDaのところにバンドが出ています。
WBのサンプルですが、RIPA bufferにProteinase inhibitorを入れてsusupend・超音波を行い、遠心した上清に、1/10 vol.の2-MEを入れたlaemmle bufferを等量加えて95℃で5分加熱処理をしています。
　
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No.5954-7 - 2017/05/02 (火) 11:04:38 - おお
すべての膜タンパクと言うわけでもないのであしからず

(無題) 削除/引用
No.5954-6 - 2017/05/02 (火) 10:54:09 - まっくろん
　うちでも膜タンパク質をWBで見てます（といっても何回も貫通しているものではありませんが）。95℃-5分で処理してましたが。検出できないことが度々起こるため，フォーラムの情報を参考に現在は60℃-15分で行っています。こちらのターゲットに限るかもしれませんが，きれいに検出できる印象です。

(無題) 削除/引用
No.5954-5 - 2017/05/02 (火) 09:16:52 - みゃーご
>膜タンパク質のように疎水性ドメインを持つタンパク質はボイルすると強く凝集します。ボイルしないで、温和な温度長時間、SDS化するのが一般的でしょう。

なるほど！膜タンパクは初WBだったので知りませんでした！
とても勉強になりました。
膜タンパク抽出用の方法を用いてもう一度やってみます！
またダメだったら他の可能性を考えてみます。

皆様、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用
No.5954-4 - 2017/05/02 (火) 05:13:11 - おお
その蛋白の名前は開示できますか？
またその蛋白に体する抗体のカタログの図とか、タグ付きで発現している実験で発表されているデーターなどは調べてみましたか？

(無題) 削除/引用
No.5954-3 - 2017/05/01 (月) 20:57:25 - mon
過剰発現で正常にフォールディングできず、ポリユビキチン化とか。

(無題) 削除/引用
No.5954-2 - 2017/05/01 (月) 18:53:41 - AP
膜タンパク質なんですよね。
だとしたらよく知られていてこのフォーラムでも度々話題に上がっている凝集現象の可能性が高そうです。
膜タンパク質のように疎水性ドメインを持つタンパク質はボイルすると強く凝集します。ボイルしないで、温和な温度長時間、SDS化するのが一般的でしょう。条件のいろいろは過去トピやGoogleで検索。

ウェスタンのバンドが上のほうに出ます 削除/引用
No.5954-1 - 2017/05/01 (月) 18:27:18 - みゃーご
いつも拝読しており、とても勉強になります。

購入したORFを用いてC末端にFlagがつくようなconstructを作製し、制限酵素でinsert確認、PCRで方向確認、シーケンスで配列確認をしました。

transientに細胞にtransfectionしてウェスタンブロッティングしたのですが、想定が30kDaなのに対し、実際にバンドが出たのはマーカーの一番上のバンドより上でした。なんならほとんど泳動が出来ない状況です(controlサンプルにはそういったシグナルが見られないので恐らくFlagのシグナルだと思います）。

考えられることとして
@aggrigateしてる
A膜タンパクなので修飾を受けてる
かなと思って、@の可能性を排除するため超音波でよく破砕してWBしましたがやはり同じ症状になりました。
vectorを入れ替えても同じようになります。
Aという可能性もなくはないですが、修飾でそんなに流れないほどになるものでしょうか？

ちなみにターゲット遺伝子自体の抗体をメーカーHPで見ると普通に30kDaのところにバンドが出ています。
WBのサンプルですが、RIPA bufferにProteinase inhibitorを入れてsusupend・超音波を行い、遠心した上清に、1/10 vol.の2-MEを入れたlaemmle bufferを等量加えて95℃で5分加熱処理をしています。
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