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(無題) 削除/引用 No.5951-6 - 2017/05/09 (火) 13:18:17 - asan フィルターかけてコンタミすることってないですけど？フィルターに穴が開く？か、漏れたかとしか思えませんね。 FACSでFSC/SSCでサイズが分かれると思うので、丁寧にやれば大丈夫そうですけどね。今時のレンチは普通にCMVとか使ってると思うので、パッケージング細胞でも発現してるのでしょう。 まあ、限界希釈で小スケールから増やすしかないですが、正常繊維化細胞だと増殖リミットがあるので難しいでしょうか？ ちなみに293TはエピソーマルでSV40oriは結構出る続けますし、ランダムインテグレードされる細胞もわずかながらいるので、一概にGFP陽性細胞がいないとも限りませんよ。

(無題) 削除/引用 No.5951-5 - 2017/05/03 (水) 12:26:30 - サンショウウオ 限外希釈法でうまくいって2週間ぐらい。 96well2枚ぐらいに　平均1~2cell/wellで播種してシングル・セルクローニング

(無題) 削除/引用 No.5951-4 - 2017/05/01 (月) 03:10:57 - CD たしか、不死化していないヒト皮膚線維芽細胞の限界は50PDLくらいでしたか。限界に近づけば表現型も変わりうるでしょうし、おおさんの仰る通りシングル拾って増やして、と言う手はあまりうまくないように思います。 現在どれくらいパッセージを重ねているかはわかりませんが、レスキューを頑張るよりも新しく作り直したほうが安全のようにも思います。完全に２９３Tを排除するのも難しいでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.5951-3 - 2017/04/30 (日) 13:52:56 - おお シングルセルクローニングはたしかにそうなんだけど、、、ヒトせいんが細胞のプライマリー、、、老化してしまうのが気になるところだし、感染前のストックがあればシングルセルクローニングより手間がかからないので、、、 表面抗原などに違いがあればそれによってソウティングとかはできるけど。。。 ヒト正常線維芽細胞であれば低血清で細胞周期を停止できる ので、そういう条件で２９３Tが死んでくれればいいけどねぇ、、、 また細胞周期が線維芽細胞で止まった時点でBrdUとか取り込ませて、光を当てて増殖した細胞だけ殺すとかそういう方法があったような気がします。 あとはPercollとかで密度の違いとかでわけれるんだったらそれもやりようがあるかもしれない。 そういえば最近キットで組織からがん細胞だけを分離できるというキットがあったような。分離したあとの残りに線維芽細胞が濃縮されてればいいのかもしれないけど保証はないな（２９３はヌードマウスにつくので癌化しているといえるので）。 ただし完全に除けるとは思えないなぁ。。。

シングルセルクローニング 削除/引用 No.5951-2 - 2017/04/30 (日) 12:45:27 - Karas シングルセルクローニングをしましょう。 本来であれば細胞株樹立の際にシングルセルクローニングをすることでばらつきのない安定した細胞株を作り出すものですが、今からでも遅くはありません。 方法自体は特別な機器は一切いらない簡単なもので、成書にも載っています。

貴重な細胞に293Tがコンタミしてしまいました。 削除/引用 No.5951-1 - 2017/04/30 (日) 10:44:03 - 293T 非常に幼稚なトピックで大変恐縮なのですが、お知恵を拝見できればと思い、トピックを作成いたしました。 ヒト線維芽細胞にレンチウイルスベクターを利用して、GFP発現細胞をソーティングにて作成しました。 しかし、パッケージング細胞として使った293Tがコンタミしており、GFP陽性をソーティングしても分取されてきてしまいました。（感染後、10日ほどかけて線維芽細胞を増やしていたので、一過性に導入された293Tが分取されたというわけではなさそうです）。たぶんウイルス液を回収して、フィルトレート（0.22）した際、根詰まりして強引にウイルス液を出してしまったことが原因と思います。 もう一度やり直せばいいのですが、細胞がプライマリということもあり、またリバイス期間中で今の細胞をレスキューできればと思っています。 今のところ、線維芽細胞のディッシュをHBSS（-）でウォッシュして、しばらくHBSS（-）に付けておくと293Tが剥がれてくるので、それでなんとか維持しています。実際、それで免疫染色なども行ったりしており、実験は問題なくできていますが、気持ち悪いのと、ストックを考えているので、できれば293Tを壊滅させたいです。 どうにかレスキューする方法はありませんでしょうか？大変幼稚な質問で誠に恐縮していますが、どうかお知恵を拝借させていただければ幸いに存じます。どうぞよろしくお願いいたします。

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