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(無題) 削除/引用 No.5950-3 - 2017/04/30 (日) 05:02:39 - おお >コンタミやゲノム由来の非特異も疑ってはいますが、 なぜcDNA由来の非特異が除外されているのか、、、 >non-RTコントロールから目的産物と同じバンド サイズが同じとしても同じ配列とは限らないから、配列を読むか制限酵素で切って予想通りに切れるかなど何か確認してもいいのでは？もし配列が違うならコンタミは除外できるのだから、PCRの条件を厳しくするか場合によってはプライマーを変えるか。 >皆さんのcDNAの希釈倍率がどのぐらいで、低くてどこから、高くてどこまで、 標準的なプロトコールでしたらインプットしたRNAの量で数十ngを使いますが、実験によっては多くのRNAが期待できずもっと低い量を加えることは多々あると思います。基本的に１コピーあれば増えますし検出限界を下回らない限り減らしていくことは特に変なことではないですが、うすすぎるとチューブに吸着してしまう量が無視できなくなります。ナノグラムオーダーならまあ大丈夫でしょう。

(無題) 削除/引用 No.5950-2 - 2017/04/30 (日) 00:19:29 - 名無し 質問者の言う希釈の意味がイマイチわからないです。 手元にある（古い）テキストによれば、最終的に出来上がるPCR産物の量に対して25から50分の一の量のcDNAを使うとあります。私はクローニングはよくやりますが、この際25 ulのPCRの系に対して0.25 ul から 0.5 ulのcDNAを使うことが多いです。 トピ主さんは、cDNA溶液を5倍希釈した後、何ulのPCRの系に対してどれ位使っておられるのでしょうか？

RT-PCRの際のcDNAの希釈倍率はどこからが適切？ 削除/引用 No.5950-1 - 2017/04/29 (土) 19:30:35 - 逆上　増乃助 いつも大変参考になる議論があり、こちらの掲示板には感謝しております。 表題の通り、RT-PCRの際に行う、cDNAの希釈倍率についてです。 皆さんご存知の通り逆転写後のcDNAにはPCRの阻害作用がありますが それを避けるためのcDNAの希釈倍率について、皆さんのご意見を聞きたく思います。 私は組織由来のcDNAを水やらTEで5倍希釈して用いています。 これでRT-qPCRだとかcDNAのクローニングだとか、おおむね上手く行っています。 しかし、最近になって、大きいイントロンを挟んだプライマーでのRT-PCRで、non-RTコントロールから目的産物と同じバンドが出てくるという現象が頻発しています。 コンタミやゲノム由来の非特異も疑ってはいますが、もしかしたら希釈倍率が低すぎてゲノムをひっかけてしまっているのかな、とも思っています。 希釈倍率を上げられればサンプルにも余裕ができて精神的にも楽ですし。 そこで、皆さんのcDNAの希釈倍率がどのぐらいで、低くてどこから、高くてどこまで、と言うものを調べたく思い、トピックを立てさせていただきました。 ネット上では20倍希釈、というのを頻繁に見かけますが、どこから現れた希釈倍率なのか、と言うのも気になっております。 皆さん、よろしくお願いいたします。

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