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(無題) 削除/引用 No.595-9 - 2012/06/05 (火) 11:20:18 - ａα トピックを立てるところ、このトピックに間違って投稿してしまいました。申し訳ありません。

接合型依存的な酵母growth phenotype 削除/引用 No.595-8 - 2012/06/05 (火) 11:17:49 - ａα とある代謝酵素の遺伝子が破壊された、yeast deletion project由来のパン酵母遺伝子破壊株を取り寄せ、YPAD完全培地で培養したところ、ａ型の増殖がα型より遅いことが分かりました。 個体培地、液体培地を問わず生育速度の差は明らかです。一方、親株だとａ型とα型で目立った増殖速度の差は感じられません。目的遺伝子の破壊はａ型、α型とも確認済みです。 何かの遺伝子破壊の影響が、vegetative growth rateにおいて、片方の接合型でだけ強く表れることはよくあることなのでしょうか。それとも、予期しない変異など何らかのトラブルが強く疑われ、バッククロスなどで対処すべきでしょうか。 皆様の知恵をお借りしたいと思います。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.595-7 - 2012/06/02 (土) 06:29:48 - まさ NEさん ありがとうございます。レポーターアッセイだけですべてのことは言えないとのこと、納得いたしました。 ~さん 文献までつけてくださって、ありがとうございました。プロモーター活性はゲノム内にインテグレートされた遺伝子と、エピソーム内の遺伝子とでは、全く違うこともあるということですね。その正確な理由は特定されていないように思いましたが、かなりインパクトの高い雑誌に掲載されていて、説得力がありますね。自分でももっと調べてみようと思います。 ＞先行研究の配列そのものではないという意味でしょうか？ 説明が悪く申し訳ありませんでした。この遺伝子のプロモーターに関して数編の論文を見てみると、まちまちですが、大体同じくらいの長さの領域をつかっていました。そのなかから、ひとつの論文のauthorに頼んで、プラスミドをいただきましたので、その論文と同じです。私は薬剤による応答を見ていて、同じ薬剤を使用している論文はありませんので、”同じ結果であることを確認する”ことは、難しいと思います。 ＞この先行研究ではプラスミドDNAとゲノムDNAでの違いが報告されているのでしょうか？ 特にそういった報告はないと思います。 私の実験で、RNAは下がるのに、プロモーター活性は上昇したことに関して、１）プロモーターの長さが不十分で偽陰性の結果になった。２）あくまで人工的なプラスミド上での結果であるので、実際のRNAの結果がリアルである。という風に理解しました。 あと、転写後のRNAの生成や分解などにも、この薬剤が影響するようなこともあるのではとも考えました。自分でもいろいろ調べてみようと思います。非常に勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.595-6 - 2012/06/01 (金) 10:44:55 - ~ >機能的面でまったく同じ http://www.pnas.org/content/98/26/15233.full フィギアの絵しか見ていませんが、plasmidとintegratedでルシフェラーゼ活性が変わっていますね。 >文献上、同じ遺伝子で大体、その程度を使っている とありますが、この先行研究ではプラスミドDNAとゲノムDNAでの違いが報告されているのでしょうか？ そこでは同じ挙動を示すという報告がされているのであれば、今回新しく異なる挙動についての報告ができるのかもしれませんね。 ただ、プロモーターアッセイであれば、10bp削れば応答が変わることもありますが、"その程度"というのは先行研究の配列そのものではないという意味でしょうか？ 先行研究が必ずしも正しい結果であるとは限りませんが、同じ結果が出ていることは確認しておいたほうがいいでしょう。 そのため、長い配列をクローニングするのもいいですが、先行研究と同じ配列をクローニングし、それが報告と同じ挙動を示すかも押さえておいたほうがいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.595-4 - 2012/06/01 (金) 08:25:58 - NE レポーターアッセイはあくまで人工的な系なので、本来のゲノム上の機構とまったく同じではないと思います。そもそも、人工的にプラスミドとして入れている時点で、別物ではないでしょうか？予想した結果と同じであれば本来のゲノム上の機構と似ているかもしれないし、予想した結果と異なれば本来のゲノム上の機構と似ていないかもしれない。レポーターアッセイを現象を見る目安として使用するのはいいと思いますが、レポーターアッセイだけで現象をすべて説明しようとするのはどうかと思います。別の実験系も組み合わせて、本来のゲノム上の機構を判断することが必要だと思います。

エピジェネティックスの違い？？ 削除/引用 No.595-3 - 2012/06/01 (金) 00:39:18 - まさ ~ さん どうもありがとうございます。私の使っているのは1.4ｋｂです。文献上、同じ遺伝子で大体、その程度を使っているので、私もそうしました。もっと上流も見る必要がありそうですね。ありがとうございます。 もうひとつの私の懸念として、細胞内に一過性に導入されたプラスミドDNAと、本来のゲノム上のDNAは、機能的面でまったく同じといっていいのだろうかというものです。たちえばクロマチンの形成が若干違い、本来のエピジェネティックス制御とは違う制御を受ける可能性はないのだろうか、と思っております。ご意見ございましたら、お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.595-2 - 2012/05/31 (木) 09:08:03 - ~ そもそも、レポーターアッセイということはあるDNA領域が転写に及ぼす影響を見る実験系ですよね。 その領域が目的遺伝子の転写調節に十分であることを示す必要があるのは、実験者自身です。 レポーターアッセイと実際のクロマチンで転写調節が異なるということは、レポーターアッセイに使用しているDNA領域が不足しているのでしょう。 転写開始点から100kb以上離れている転写調節領域も報告されていますので、レポーターアッセイに使用するDNA領域の範囲は十分に検討する必要があります。

プロモーター活性と発現量 削除/引用 No.595-1 - 2012/05/31 (木) 07:32:08 - まさ レポーターアッセイを使って、薬剤投与によるある遺伝子のプロモーター活性を見ています。レポーターベクターで起こることと、実際のクロマチンで起こることは違う可能性もあるでしょうか。実際その遺伝子のmRNAは約半分くらいに減るのに、プロモーター活性は４倍くらいにあがっています。よろしくお願いいたします。

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