全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5945-11 - 2017/04/29 (土) 03:57:26 - おお 蛋白の結合活性をしらべるのにpH１２とかは無茶でしょう。あまりにも生理的な条件からかけ離れていますし、そういった状態でタンパク質が変性していることは容易に察しがつきます。 生理的な状態は関係なく蛋白の物性とか調べるとか、よほど特殊な生物で特殊な環境でそういうタンパク質が存在するとか言う場合にはありうるかもしれませんけど。だから役に立たない情報と思いますがアガロースでNaOH溶液で泳動するという方法はあります・DNAを一本鎖の状態で電気泳動する手法です。 お示しのような実験ではむしろHPLCなどを使ってゲルろ過でサイズのシフトを見たほうがわかりやすいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.5945-10 - 2017/04/29 (土) 00:04:19 - BAS 皆さま 沢山のアドバイス本当にありがとうございます。極めて参考になります。 APさんの最初のコメントですが、最初に書いた説明では何をしてるのか不明瞭すぎましたね。 実は、ペプチドの分離を試みているのではなくて全く逆の、ペプチドと相互作用するパートナーを探索している感じです。ヒトcell lysateと蛍光ラベルペプチドを共培養して、いわゆるゲルシフトが起こるかどうかを見ています。 最初に書いた通りライセートと培養したら複数のバンドが見られ、ライセートなしのレーンではそれらは（ほとんど）見られないのですが、ライセートなしのレーンではそもそものフリーペプチドが泳動のフロントラインにすら見当たらず、また実は『ほとんど』と書いた通り、流すペプチドの量を極めて大きくしたら、フリーのレーンにもうっすらとそのシフトバンドと同じパターンが見られるということもあって（もちろん共培養時に見られる非常に強いものより遥かに小さなシグナルですが）、ひょっとしたらそのシフトパターンは単にアグリゲートか何らかの関係無いものを見ているだけなのじゃないかということで、とりあえずフリーのペプチドがきちんと流れるような条件を探ろうとしている段階です。 そういった理由で、電極逆転の系は一瞬良さそうだなとも思ったのですが、見れていたもの＆本来見たいものが見れなくなってしまう危険性がありますね。しかし、試してみる価値はありそうです。 おおさんのアガロースも全く頭にありませんでしたが、ひょっとしたらアガロースで両極に流すのは非常にいい案かもしれません。 長くなりましたが、重ね重ね有益なアドバイスどうもありがとうございました。色々やってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.5945-9 - 2017/04/28 (金) 14:55:48 - おお アガロースでどちらの電極への移動もみれる電気泳動は紹介したけど、状況、工夫にもよるけどそんなに分離能が良くないかもしれません。 もしかしたらディスクゲルでやるとPAGEでできるかもしれません。ディスクの半分PAGEを重合してサンプル、サンプルの上にアガロースをちょっと載っけてその上にPAGEを重合とかしてやれば。

(無題) 削除/引用 No.5945-8 - 2017/04/28 (金) 14:45:50 - AP >ペプチド（蛍光ラベル） >複数のバンド（蛍光シグナル） と書いておろう

(無題) 削除/引用 No.5945-7 - 2017/04/28 (金) 13:49:33 - toto ペプチドをゲルで流す場合、単体では染色液で固定されず染色-脱色中に抜けてしまう事がありますが、その点は大丈夫ですか？検出はどのようにされてます？

(無題) 削除/引用 No.5945-6 - 2017/04/28 (金) 12:40:45 - おお 電流を反対に流してゲルに入れる（ただバッファー組成はたしか違うと思う）方法は塩基性の強い蛋白でやることがあります。それでは従来の方向に流れるものが見れないというなら、サブマリン型の電気泳動層で、アガロースゲルなどで真ん中にWellを作り（コームを指す位置が単に真ん中）電気泳動するというのも実際にやることがあります。

(無題) 削除/引用 No.5945-5 - 2017/04/28 (金) 11:33:05 - mon アルギニン（+リン酸、+クエン酸、+グルタミン酸）も使えるかな？

(無題) 削除/引用 No.5945-4 - 2017/04/28 (金) 10:13:28 - AP ただの野次馬なんだけれど、何の目的で、どういう試料のなかにある状態からそのペプチドを分離するのかしら？　 ただ分離するなら電気泳動しか方法がないわけでもないし。 分子量に従った分離でなければならないのか、ともかく分離出来ればいいのか？ いっそ、陰極側に向けて移動させるんじゃだめでしょうか。非変性電気泳動ではそれもありですよね（セルロースアセテート膜電気泳動とか）。

(無題) 削除/引用 No.5945-3 - 2017/04/28 (金) 09:50:40 - BAS monさん ありがとうございます。丸投げせず自分でも調べるべきだと思ったんですが、高pHのバッファーって中々ないんですよね…。pH 12よりもう少し高い所がベストなんですが、多少緩衝能を犠牲にしても、気持ち12より高めの所で、Gly-NaOHの系、試してみようと思います。 有用な情報大変ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5945-2 - 2017/04/28 (金) 09:33:44 - mon 手元の本によると、Glycine-NaOHがpH12まで使えるようです。

電気泳動で使える塩基性バッファー 削除/引用 No.5945-1 - 2017/04/28 (金) 04:09:00 - BAS 極めて小さいサイズのペプチド（蛍光ラベル）のNative-PAGEを行いたいのですが、かなりpIの高いペプチドのため、サンプルバッファーや濃縮ゲルのpHを分離ゲルと同じpH 8.8まで上げて泳動しても、フリーのペプチドが陽極へ移動してくれませんでした。 Blue Native-PAGEも行ったのですが、ペプチドが小さすぎるからか、CBB G-250によるネガティブチャージ付与が恐らく不十分で、これも全く思うように泳動されませんでした。 ちなみに細胞懸濁液と混ぜたサンプルでは、恐らくペプチドはパートナーと相互作用しているため、しっかりとゲル内に入り複数のバンド（蛍光シグナル）が確認できています。 そこで、より塩基性のバッファー・ゲルで試してみることになったのですが（その条件が相互作用を見るのに適切であるかは議論の余地がありそうですが、それはひとまず置いておいて）、Trisではあまりに高pH領域では緩衝作用がない、というよりそもそも塩酸を加えないTris baseの水溶液でもpH 11かそこらだと思うので、もう少し高いpHの系が欲しい現状では適切ではなさそうです。 どなたか電気泳動に使える高アルカリ性のバッファーをご存知の方がいらっしゃいましたら、ご助言いただけると大変ありがたいです。 よろしくお願いします。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---