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(無題) 削除/引用 No.5932-14 - 2018/02/08 (木) 15:08:51 - AP ボットにより召喚されて蘇ったのか、このスレッド。 酵素が悪いから変異が入ったと、酵素のせいばかりにしがちですけれど、反応条件にむとんちゃくで不適切な反応をさせている、というのも多いんじゃないかと思います。 サイクルが過剰とか鋳型を入れすぎとかで反応産物が過密になり基質が枯渇してくると変異が入りやすくなります。error-prone PCRでmutagenesisするときなんかはそれを逆手にとって変異率を上げるわけですが。 点変異導入などの目的で、エラーの入っていないプラスミドの鋳型なんかで、15サイクルとかでPCRをかけるんだったらコンベンショナルなTaqでも変異が多発して手を焼くなんてことにはなったことないですもの。 プライマリークローニングだとどうしてもサイクル数を上げなければならないですが、あんまり無茶なことはしないほうがいいですね。

(無題) 削除/引用 No.5932-13 - 2018/02/08 (木) 14:20:16 - ふと思う PrimeSTAR HS DNA Polymerase, KOD -Plus- Ver.2 両者とも2005年に販売されたものですね。 最近はもっと良いのもあるのですかね。

(無題) 削除/引用 No.5932-12 - 2018/02/07 (水) 00:32:20 - toto 今は、ほぼうまくいくので、KODplusNeoーこのその場しのぎの命名法、なんとかならないものかというのはさておきーだけにしてます。ただ、皆さん仰るように、意外と変異が起きます。カタログ数値よりも高い頻度な印象ですが、もっとも、意外ととは言っても、滅多には起きないし、PCRそのものなのか、NEBuilderでつないでるところなのか、あるいは菌体の中かの区別がつかないので、他の酵素との比較はしてません。変異があれば修復するだけです。そのときに変異が起きて収拾つかなくなるほどの高いエラー頻度ではないので。

(無題) 削除/引用 No.5932-10 - 2017/04/29 (土) 06:54:47 - フィデル 皆さまありがとうございます。 実は僕も九院様と同じで、KOD plusでAの連続配列でのスリップが立て続けに起こりました。それまではKOD信者だったのですが、以来いろいろ試すのもいいかも・・・と思うにいたりました。九院様の書き込みをみて、同じだ！と少々おどろきました。 N=2でKODがAの連続配列に弱いとは言えないとおもいますが、特定の配列に弱い酵素など、知られているものはあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5932-9 - 2017/04/27 (木) 17:38:53 - AP 酵素ミックス型の製品はすでに色々でてますけどね。 Takara ExTaq Roche Expand HiFi Stratagene にはPfu wtとexo-をミックスした製品なんかもあった。

(無題) 削除/引用 No.5932-8 - 2017/04/27 (木) 16:59:56 - サンショウウオ ふと思う。 　 　ポリメラーゼ混ぜたら良い事無いだろうか。 　バッファー違うとだめかな？

(無題) 削除/引用 No.5932-7 - 2017/04/27 (木) 15:00:24 - ゴロキング KODは悪くないけどバッファーが・・・というのが， 学生時代の印象でしたが， 結局，DMSO，ベタインを一緒に使うと，増幅効率が高まり， 今は何ら問題なくというか，変える必要もなくなりました． （最初からバッファー改良したものを入れてくれるとなおありがたい！） FXにせよPlus Neoにせよ不満はないですね． FXはcrudeでもよく増えるので，重宝しています． なおPrimeSTARも使ったことはありますが，これも優秀で， 不満な点は特になかったです． ただ，GCリッチの長い断片はFXでのみ増えたことがあったため， 以降離れられなくなりました・・．

(無題) 削除/引用 No.5932-6 - 2017/04/26 (水) 08:51:04 - MP KOD plus, pfu ultraで全く増えなかったものが、PrimeSTARでばっちり増えたという経験があり、正確性が同等と仮定したうえでもっぱらPrimeSTAR専です。正確性に関してはたまに3kbあたり１塩基程度のエラーを経験しますが、PrimeSTAR MAXあたりだと、かなり改善されているのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5932-5 - 2017/04/26 (水) 07:35:27 - 九院 院生の頃の使用感ではKOD plus, KOD plus ver.2のほうがPrimeStarよりは増幅がよかった印象があります。変異は難しい断片でなければ、特に差異はないように思います。特に、KOD plus(2)+DMSOの組み合わせが、変異もなく最もよく増幅した組み合わせでした。ですので、クローニングにはほとんどKOD plusを使っていました。残念ながら当時はPrimeStarGXLは発売前でしたので、使ったことがないのでわかりません。cDNAを鋳型にした場合もゲノムを鋳型にした場合も同じ印象です。 ただし、KOD plusは連続した配列が苦手なようで、クローニングに苦労したことがあります。同じDNA断片を増幅したわけではないですが、KOD plusやKOD plus ver.2ではAの連続配列(15-25bpほど。正確な数を思い出せない)はスリップするのか、数塩基の欠失、挿入でなかなか正しいクローンが取れませんでしたが、Q5ではすぐに正しいクローンが取れました。 同じDNA断片の増幅ではQ5よりはPhusionの方が増幅は良い印象です。 カタログベースではQ5の方がPhusionよりも正確性が高いのでファーストチョイスとして使っていますが、Q5で増えない場合はPhusionを使うというような使い分けをしています。 現在はヨーロッパにいて、KODやPrimeStarを使っていないので、Q5やPhusionとの直接の比較ができませんが、感覚的には増幅の良さはPhusionが一番良い気がします。 ちなみに正確性を別にすると増幅の良さではExTaqが最強と思っていたのですが、ゲノムをテンプレートにした場合にはQ5の方が増幅が良い場合もありました。 なので、直接の比較は互いにできていませんが、増幅の良さに関しては感覚的に以下のような印象を持っています。 Phusion>Q5>ExTaq=KOD (FX>plus)> PrimeStar 正確性に関してはターゲットの配列に依存するような気がします。 特殊な配列を除けば、近年のHIghFidelity酵素であれば、特に差はないのではないでしょうか。

ゲノムPCR 削除/引用 No.5932-4 - 2017/04/26 (水) 06:01:57 - フィデル ご意見ありがとうございます。 Q5は私のまわりでも評判がいいようです。安いし正確だとの評価です。 PrimeStarもみなさん高評価ですね。勉強になります。 最近はゲノムのPCRが多く、検体数も多いためCrude sampleでもよく走る印象のKOD FXをよく使っていますが、イントロン領域での読み違えがたまたまかもしれませんが一定の確率（といっても合計すると50kbで一か所あるかないかですが）で起きてしまって、他の酵素も試してみようかと悩んでいたところです。 ゲノムサンプルでのご経験はいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.5932-3 - 2017/04/24 (月) 10:22:48 - 毒虫 独断と偏見で、ということなのでいつも私はPrimeSRAR信者だと言って人に勧めています。ちなみに普段はPrimeSTAR GXLを使っています。GCリッチ、ATリッチ、長いもの15Kbpとか、本当に増えなかったことはまずないです。 かなりGCリッチな生物を中心に扱っていて、知り合いのポスドクもそういう人が多かった中でそれぞれの感想を聞いたところ、PfuUltraII,Phusionを推していた人、それぞれいます。私はPhusionはサンプルしか使ったことはありませんが、PfuUltraIIとPrimeSTAR GXLだと後者の方が増えない例が格段に少ないです。もう一つ新しい世代の酵素はまだ使ったことがありません。 ただ、コロニーPCRでそんな酵素はもったいないと言われそうですが、Taq系だと全く増えないことが多くて、結局無駄になるのでこの辺の酵素を使っていますが、プライマーの相性が中途半端なときにPfuUltaraIIの方が選択性が高い印象はあります。そこから勝手に性質を推測しています。 KODは酵素を何種類か揃える気にならないのと、問題がよく起こるような話を複数人から聞いているので試したことがありません。 でも質問は正確性ですよね？ PrimeSTARで、4kbpぐらいのクローニングをよくやりますが、4クローン拾って、一番悪い時でエラーが2つです。滅多にエラーは見かけません。 ただ、ブラントで繋ぐと、端が一個削れることが頻発した時期があって、その頃は酵素量2倍の高速プロトコールに、サイクル後に昔の習慣で68度5分を入れていましたが、今は止めました。dNTPが激減したのかと想像していますが真相は分かりません。

(無題) 削除/引用 No.5932-2 - 2017/04/24 (月) 06:31:16 - おお それぞれ数字が一応調べられてはいますが、土俵の違いなどあると思いますし、メーカーの数字は有利な土俵での数字かもしれませんので参考程度ですけど、 catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100004616 hindawi.com/journals/mbi/2014/287430/ neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr neb.com/tools-and-resources/selection-charts/dna-polymerase-selection-chart nature.com/nmeth/journal/v13/n6/full/nmeth.3868.html KOD、Pfu、VentR DNA Polymeraseとかは同じ世代の酵素かと思いますが、Taqよりは１オーダー前後いい感じでどんぐりの背比べ的な気がしますが、Phusion® High-Fidelity、Q5はそれよりい更にいいという謳い文句はあります。この世代はPrimeStarと同じ世代と勝手に思っているのですが（ただQ５はPhusionのあとだけど）、PrimeStarはPfuには劣ってないみたいですけどPhusion® High-Fidelity、Q5とかよりは見かけ上見劣りはしますね。。。個人的にはPfuで十分と思ってますが、PCRがPrimeStarやPhusionなどはかかりやすいようなので楽ではあるかもしれません。 KODはわたしの手ではどうもPfuよりエラーが多いんですよね、、、

結局もっとも正確なPCR酵素はなに？ 削除/引用 No.5932-1 - 2017/04/23 (日) 16:08:00 - フィデル 皆様の感想をお伺いしたくトピックをたてさせていただきました。 これまでの8年あまりの研究生活で、クローニングも何度となく行ってきました。 High Fidelityをうたう酵素として、KOD plus, KOD Fx, Primestar, Pfuなどをその時々のラボの在庫から引っ張り出して使用してきました。PCRエラーでどうしようもなく困った経験もないのですが、それぞれで1，2回ずつのエラーは経験済みです。 そこで皆さんにお尋ねしたいのですが、高正確性でいうならこれ！というおすすめの酵素はありますか？本来あまり種類をならべて比較する類のものではないかもしれませんが、ご経験に基づいた独断と偏見でもいいので教えていただければうれしいです。 よろしくお願いいたします。

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