全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5919-18 - 2017/04/21 (金) 09:47:01 - やっさ 七氏さんへ そうですazideフリーのものを使用しております。 E.coliコンタミの件ですが可能性ありますね。研究室ではE.coliを扱っていますし，E.coliを使用するクリーンベンチ内で届いたHRP抗体の分注を行いました。もちろん使用前には70%アルコールで消毒はしたのですがその消毒が甘かったのかもしれません。分注したチューブをE.coli選択培地で培養してみます。 おおさんへ HRP標識抗体は持って数ヶ月なのですね。冷蔵の時点で少しおかしいとは思いましたが推奨に従わなければならないのでまぁ仕方ないですね。こまめにELISAで活性確認するべきでした。 いくつか論文を拝見させてもらった時にはほとんどがPBSベースであったのでおかしいなと・・・

(無題) 削除/引用 No.5919-17 - 2017/04/20 (木) 14:34:58 - おお HRPは４度だったら確かにすうかげつだな。 あとどんな実験化もわからないのにPBSでいいかとかかけませんねぇ。。。たいていPBSベースであることは多いですけど、ブロッキングなどが必要かとか、ごくまれに抗体が金属イオン要求性だったり、ノンスペが多い抗体ならもっと条件を厳しくするためにわざと塩濃度を高くしたり、ターゲットの相手がPBSだけでは可溶化せずアグってしまうのでデタージェントを加えたり、、、

(無題) 削除/引用 No.5919-16 - 2017/04/20 (木) 14:12:07 - 七氏 こういう抗体は使ったことがないので間違いかもしれませんが、 抗体に大腸菌がコンタミしたら、酵素は問題ないのに力価が下がる現象が起きるのでは？ HRPだからアザイドフリーだと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.5919-15 - 2017/04/20 (木) 09:30:41 - やっさ APさんへ ここの掲示板や様々な抗体の保存を拝見させていただいたところ確かに冷凍保存が多いと感じていました． 冷蔵による劣化はおおいに考えられますね．ありがとうございます． それともう一つ質問ですがよろしいでしょうか． 現在抗原と抗体の反応溶液としてPBS（-）を使用しているのですが，これで通常問題ありませんかね？何か他に候補ありますかね？よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.5919-14 - 2017/04/19 (水) 20:14:56 - AP Abcamがどう言っているかざっと見てみた。確かに標識抗体は冷凍せず4℃で保存せよとは書いてるけど、どれだけ保つかは明記されていない。しかし、抗体一般の保存法のところには、4℃で1-2週間はacceptableなんてこと書いてあったりして。

(無題) 削除/引用 No.5919-13 - 2017/04/19 (水) 20:07:19 - AP 常識的に言って、冷蔵保存で2年も保たないよ。 各社、保存剤なんかが違って一概にはいえないけど、PO標識なら数か月以下だろう。 APなら年単位で大丈夫なのもあるけど。 買い直すんだね。

(無題) 削除/引用 No.5919-12 - 2017/04/19 (水) 18:34:03 - やっさ APさんへ 直線性のある値は以前（2年ほど前）は 10の2乗〜5乗までありました． 現在（1年前から）は 10の5乗〜7乗までしかありません． 2年ほど前のHRP標識抗体は購入したばかりであったため問題ないと考えられます．その抗体を使用した実験結果も掲載されており，10の2乗〜5乗まで直線性が見られていました． 検出試薬はDABやOPDを使用しました．HRP抗体とOPD溶液を直接反応させ， 紫外可視吸光光度計で測定を行っているため，基質に問題はありません． おおさんへ abcamの推奨保存方法で保管していました．購入し，届いたと同時にPKチューブに分注し4℃で保存しました．保存はパラフィルムで巻いておきました．

(無題) 削除/引用 No.5919-11 - 2017/04/19 (水) 15:01:09 - おお >以前（2年ほど前） 保存の仕方にもよるけど、一年、２年ぐらいの期間でWBで使う二次抗体のHRP活性は低下して検出感度が悪くなってきます。賞味期限（じゃなくってどういったらいいんだろ、Shelf lifeか）を過ぎてしまっているように思います。保存の仕方にもよるかもしれませんので、その辺も書いてみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.5919-10 - 2017/04/19 (水) 14:56:34 - おお >適当希釈した溶液でもしっかりHRPとの反応は見られます． ちゃんと数値化しないと活性がどの程度変わったかわからないよ。保存前の状態と一緒の比活性があると言えるの？またHRPではなくってその検出試薬の方は疑う余地がないの？

(無題) 削除/引用 No.5919-9 - 2017/04/19 (水) 14:27:58 - AP >返信ありがとうございます．標識抗体自体は活性が失われていません． 適当希釈した溶液でもしっかりHRPとの反応は見られます． 希釈系列でどのくらいのレンジで直線性があるだろうか。 それは、問題のない標識抗体と同等だろうか。 あるいは以前おこなった測定値と今回の測定値は同等だろうか。 完全に失活していなくてもELISAで３桁分の活性の低下はあるとは考えられないだろうか。

(無題) 削除/引用 No.5919-8 - 2017/04/19 (水) 14:17:48 - やっさ APさんへ 確かにまず変性自体を疑ったのですが，酵素自体は基質との反応性があったためそれは無いかなと考えました．

(無題) 削除/引用 No.5919-7 - 2017/04/19 (水) 14:13:38 - やっさ AP さんへ 返信ありがとうございます．標識抗体自体は活性が失われていません． 適当希釈した溶液でもしっかりHRPとの反応は見られます． Nanashi_et_al さんへ 返信ありがとうございます． 確かにすみません．質問の仕方が悪かったです．以前（2年ほど前）は直接ELISAを行った結果10の2乗〜10の7乗 CFU/mLまでダイナミックレンジが確認できたのですが．1年ほど前から10の5乗〜10の7乗 CFU/mLしか確認が出来なくなってしまっています． この結果から抗体価が弱まっているのかなと考えました．

(無題) 削除/引用 No.5919-6 - 2017/04/19 (水) 14:07:09 - AP >また，標識してあったHRPが外れてしまっている可能性も挙げられています なんでまず外れるって発想にいくかな。 酵素だもの、失活をまず念頭におくべきでしょ（生物系の人じゃないのかしら）。

(無題) 削除/引用 No.5919-5 - 2017/04/19 (水) 14:04:25 - やっさ おおさんへ 返信ありがとうございます．そうです，その抗体で検出出来ていましたのでやはり保存状態で変化してしまった等が考えられます． また，標識してあったHRPが外れてしまっている可能性も挙げられています． 標識したHRPは結合にもよると思いますがかなり強固な結合で結ばれているはずです（市販のものですので結合様式不明・・・）．外れるようなことはあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5919-4 - 2017/04/19 (水) 14:03:49 - Nanashi_et_al 「低下」というからには単に「低い」のとは違い、低下する前の状態が存在していたことを意味してることになるけど、低下する前はどうだったのか書けてないね。そうだとしたら悪い質問の仕方だと思いますよ。 もし、思い込みで「低下した」と言ってるのだとしたら言葉遣いを気を付けましょう。

(無題) 削除/引用 No.5919-3 - 2017/04/19 (水) 14:00:13 - AP 抗体自体はタフだからそうダメにならない。 それに対して標識抗体は失活しやすい。標識は生きているだろうか？ 例えば適当に希釈しただけの標識抗体に基質を入れたら、ガッツり反応するだろうか。

(無題) 削除/引用 No.5919-2 - 2017/04/19 (水) 13:41:48 - おお メーカーに相談してみたほうがいいかもですね。 そもそもその抗体で検出できていたけど検出できなくなったのですか？それなら何かまずいことが起こった可能性がありますけど、保存状態使用頻度など気をつけないこともありますし、抗体の特異性なのかHRPの活性が低下したのかどのように判断したのかも知りたいところです。

抗体の特異性低下 削除/引用 No.5919-1 - 2017/04/19 (水) 11:35:53 - やっさ 現在HRP標識抗体を使用しE.coliの検出を行っています． しかしどうもこの2者間での特異反応が見られません． というのもELISA（直接ELISA）で確認を行ったところE.coli 10の5乗 CFU/mLから反応が見られたため，E.coliと抗体の親和性が低くなっているのではないかと考えました． 使用抗体はabcamのab20425であり，E.coli全般の血清型に反応するはずなのですが・・・ 親和性低下の原因としては何がありますか？ 皆さんの力をお借りしたいです．

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---