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(無題) 削除/引用 No.5898-10 - 2017/04/14 (金) 18:10:49 - asan バックグラウンドでどれくらい増えてくるのか、ligationをしないとどのくらいバックがでるのか、インサートの生成度合いとか切り出した時にUV当てすぎとかあるのか、過去にどのくらい同じ方法でうまくいってるのかなんかにもよりますからね。 コロニーPCRに否定的な意見が多いですが、ちゃんとやれば明らかなポジティブと偽陽性はなんとなく見分けがつきます。もっと言えば、一度コロニーを突っついてレプリカ作ってからやればバックもかなり軽減できます。基本ダメならダメなんでしょう。 あとは3.3kなら普通に制限酵素つけてやってもいいでしょうね。個人的にはtaqを3.3kでやったらエラーが入りそうなのでTAクローニングするにしてもhigh fidelityの酵素を使いたいところです。 それだけでダメな理由はわかりませんから、原因がinsertにあるのか、ベクターの処理にあるのかくらいはまずは確認してみたらどうかと思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.5898-9 - 2017/04/12 (水) 04:17:42 - おお もう一つくわえるとインサートをcDNAから増幅するときのPCRの条件をできるだけ厳しく、サイクル数を抑えるのもやったほうがいいかもしれません。というのはバンドのところに本当に目的のものだけが１００％あるかという懸念がありますので。 結局わからないけど量はさておいていろいろなものができている可能性がPCRではあると思うのです。

(無題) 削除/引用 No.5898-8 - 2017/04/11 (火) 12:57:31 - ピスケ 様々な回答ありがとうございます。 以前500bpほどの断片を同じ手法でクローニングした際は上手くいっていましたので 今回上手くいかないのは非常に不思議です。 小さいラボで他にコンストラクションを行っている人がおらず、頼れる人がいません。 コロニーPCRはあまり信用しないほうがよいということも聞いたことありますので ひとまずいくつかのコロニーをミニプレップしてみて制限酵素処理、シークエンスを行ってみたいと思います。 皆様からいただいた意見を元に いろいろ試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.5898-7 - 2017/04/11 (火) 11:27:39 - Nanashi_et_al ほかのインサートの場合は上手くいってるのか？ コントロール実験は上手くいってるのか？ 同じラボで同じ道具を使って上手くいってる人はいないのか？ そのへんの情報は極秘事項でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5898-6 - 2017/04/11 (火) 09:59:00 - seventh 経験的にはゲル抽出サンプルを用いたTOPOクローニングでセルフライゲーション＆微小断片の挿入はほとんど起こらないような。たくさんがどのくらいかにもよると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.5898-5 - 2017/04/11 (火) 09:30:04 - mon 電気泳動で見えない短い断片が優先的にクローン化してしまう可能性を排除するため、3.3kbpのcDNA由来のPCR産物をゲルから切出し精製して試みてはいかがでしょうか。 TA cloningではないですが、Blunt-TOPO kitにどうしてもクローン化出来ず、primerに別の配列を付加してもNG、そこでprimerに組み込んであった制限酵素部位で全く別の培養細胞用発現ベクターへは直接ligation。結果OKというヒト由来cDNA(CDS)がありました。大腸菌プロモーター様配列も含まれてなく、原因不明です。。 こんなこともありますので、 TOPO TA cloning kitへのクローニングが最終目的ではないでしょうから、あまり拘らずに別のベクターを試すことをお薦めします。

(無題) 削除/引用 No.5898-4 - 2017/04/11 (火) 02:56:23 - おお コロニーPCRはバンドが出ないときにあまり信用してないんですが、その１kとか５００とかのものも含めて何個か実際にプラスミドを抽出して入っているか確認されたでしょうか？ ゲル抽出のときにあてるUVがあまり良くないということもしばしここで議論されますが、そういうことに関して対処してないようでしたら工夫が必要かもしれません。コンピの相性などもありますので（とくにPCR産物はメチレーションが施されてないので分解しやすいですから）、何を使っているか開示するか、ご自身で調べられて違うものを選ぶのも手かと。あまり理論的じゃなくてもコンピ変えるとうまくいくケースもありますし。 ３kの長いインサートをコロニーPCRで引っ掛けようとしていますが、プライマーが良ければそれでも問題ないでしょうけど、PCRプロダクトが短いほうがより検出に難が減るので、インサートないとベクターの部分で５００前後のプロダクトができるようにプライマーを作ってみるのも手かと思います。

(無題) 削除/引用 No.5898-3 - 2017/04/11 (火) 00:30:59 - 毒虫 インサートを入れるときにピペッティングをしない。これで改善することがあります。

(無題) 削除/引用 No.5898-2 - 2017/04/10 (月) 22:58:55 - 害虫 できる人にやってもらうか、外注する。 それだけの情報では、忍耐強く頑張るくらいしか言えない。

うまくいかないクローニング 削除/引用 No.5898-1 - 2017/04/10 (月) 22:08:08 - ピスケ 初めて質問させていただきます。 3.3kbpのcDNA由来のPCR産物をクローニングしようとしています。 invitrogenのTOPO TA cloning kit を使っています。 cDNAをGo Taqで増幅してゲル抽出し、TAクローニングのインサートとしています。 コロニーはたくさん生えますが、コロニーPCRをしても当たりがありません。 コロニーPCRをした結果、ほとんど空のベクター、１割くらいの割合で1kbpや500bpの目的でないバンドが出てきます。 何度行っても同じような状況で困っています。 みなさまから何かアドバイスをいただきたく思います。 よろしくお願い致します。

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