全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5897-13 - 2017/04/13 (木) 20:51:37 - BB 中年様 こちらこそ教えて頂いたのに、あげつらうようなことを言ってしまい申し訳ありません。おっしゃるとおり、まずは基質特異性と内在的な基質に対する反応が問題にならないということがクリアできればOKだと思います。その点でTEVは最適だと思います。 欲を言えば、発現ではなくて局在の変化でproteaseのON/OFFが示されている系があればいいなと思い、グダグダと言ってしまいました。 splitの系が上手くいくのか、それとも発現量の調整で対応可能なのかは、いくつか試してみます。どちらにせよtune-upが必要だと考えています。 この質問するまでTEVやsplit-ubのことも全く知りませんでしたが、皆様に教えて頂いたことを勉強することで、どういうキーワードで調べると良いかわかってきました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5897-12 - 2017/04/13 (木) 18:17:59 - 中年 すみません、挙げた論文は確かに適当ではありませんでしたね。 でも、split-ubiquitinやNotchみたいな会合のステップと切断のステップが素過程としては別反応である系と違って、プロテアーゼによる特異的基質の切断というメカニズムを利用するかぎり、基質特異性が高いこと以外にアプリオリに必要とされる性質ってあるのでしょうか。例えば酵素として比活性が弱いことはバックグラウンドを下げるかもしれませんが、それは発現量や反応時間でコントロールすべきことのように思います。 仰るように、試してみるより他にないのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.5897-11 - 2017/04/13 (木) 15:14:48 - BB 中年様、おお様、ありがとうございます。 おお様のおっしゃるとおり、集積(proximity)の有無に関係なくTEV proteaseが作用する可能性というのは僕も心配です。特異性はかなり高いみたいですのでoff-targetを心配する必要はなさそうですが、on-targetでも自然に会合し想定した刺激なしで切断する可能性ですね。中年様に教えていただいた論文のうちCell, Dev Cellの２つはNLSをつけているようで、大まかなlocalizationを調整することで効果を限定できるのかもしれません。ただ、どれも基本的なproteaseのON/OFFは「TEV proteaseの発現」により制御されている系ではないかと思います。 私からもTEV proteaseについて PMID: 23589865 ER膜内に局在化させる（膜タンパク質との融合でもworkすることを示唆） PMID: 17072307 split-TEV. これは原理的にはsplit-ubとほとんど同じですね。protein-protein interactionを検出 この分野は全く素人ですので、正直言ってどれがworkするかという判断はつきませんが、大変勉強になりました。いくつか案が浮かびましたので試作品として作って評価してみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5897-10 - 2017/04/12 (水) 12:55:53 - おお >[Re:9] 中年さんは書きました : > おおさま、 > > 今検索してたまたま出て来たものでキーになるような文献ではないかもしれませんが、たとえば次のようなもの。 > > PMID: 24829382 > PMID: 18267092 > PMID: 11081625 ありがとうごさいました。大変参考になります。

(無題) 削除/引用 No.5897-9 - 2017/04/12 (水) 08:34:13 - 中年 おおさま、 今検索してたまたま出て来たものでキーになるような文献ではないかもしれませんが、たとえば次のようなもの。 PMID: 24829382 PMID: 18267092 PMID: 11081625 separaseのような特異的proteaseの代わりに、想定される基質をTEV proteaseで切断しても同じことが起こるか否か、というような実験に使われることが多い印象があります。つまり、in vivoでもその程度には特異的であるということだと思います。TEV proteaseを何かとのfusionタンパク質として発現することで、基質とのproximity無しで切断しないという条件を作り出しているのだと思います（ここでの要請に近い条件）。

(無題) 削除/引用 No.5897-8 - 2017/04/12 (水) 03:18:13 - おお >[Re:5] BBさんは書きました : > notchは諸事情により使えないのですが、いわゆるsynNotchというシステムに感化されて始めようとしている系なので、まさにそのイメージです。 小胞体にあってストレスを感知してサイトゾル側の部分が切断されて核移行するといった蛋白もあったような気がします。あともう一つNotch likeな挙動を示すものを聞いたことがありますが具体的には思い出せません。

(無題) 削除/引用 No.5897-7 - 2017/04/12 (水) 03:14:53 - おお >[Re:6] 中年さんは書きました : > そういうことでしたら、広く使われて実績が多いのはtrackerさんが挙げておられるTEVプロテアーゼでしょうね。 特に批判するつもりはないのですが、リコンビナント精製などで使われているプロテアーゼって溶液で混ぜておくだけでアフィニティーは関係なく切れますよね。。。濃度的にはかなりの量かもしれませんけど、そういうものが細胞にあると言うのが気になりますが、実績という点で細胞内で何か特定の物を切断するのに使われているという実績があるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5897-6 - 2017/04/11 (火) 14:13:45 - 中年 そういうことでしたら、広く使われて実績が多いのはtrackerさんが挙げておられるTEVプロテアーゼでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.5897-5 - 2017/04/11 (火) 11:56:05 - BB みなさまありがとうござます。 システムの説明が曖昧で申し訳ありません。 タンパク質発現系に使うプロテアーゼは確かに使えそうです。split ubiquitinも転写因子の切り離しによる活性化で受容体間の会合を評価する系で良く使われているみたいですね。勉強になりました。notchは諸事情により使えないのですが、いわゆるsynNotchというシステムに感化されて始めようとしている系なので、まさにそのイメージです。 やってみないとわからない分野ではありますが、これはと思うものがありましたら引き続きご提案頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.5897-4 - 2017/04/11 (火) 08:01:23 - 中年 膜タンパク質同士の相互作用の検出なら、split-ubiquitinを使う方法もありますね。

(無題) 削除/引用 No.5897-3 - 2017/04/11 (火) 07:33:49 - おお 受容体どんなやつなのかよくわからないですが、膜タンパクならNotchのシグナリングでは細胞質側が切れて核に移行するということが起こるので、そういうのを利用できないかな？ただNotchのシグナリングは生理的に起こっているがなかなか捉えにくい現象だとはきいたけど。 Caspaseは下流にシグナルが伝わってしまうのがなんかいやですね。また活性化するのに２量体を形成するのが必要という話もありますから、、、それに活性化するということはCaspase自身が切断されてあなたの融合した蛋白から遊離するのではと、、、遊離しないようにうまく融合させることができるならいいですが。

(無題) 削除/引用 No.5897-2 - 2017/04/10 (月) 19:20:52 - tracker タンパク精製で使うようなプロテアーゼとかは割と基質特異性が高いと思います。 TEVプロテアーゼとかですかね。Factor Xaやトロンビンは少々認識が甘かったかもしれません。 あとはFLAGとエンテロキナーゼの組み合わせとかですかね。 本来集積し得ないもの同士が、プロテアーゼと基質のアフィニティーで集積してしまったりしないか心配ですが。 FRETなどはどうなんでしょう。

配列特異的なprotease 削除/引用 No.5897-1 - 2017/04/10 (月) 17:54:50 - BB いつも勉強させていただいております。 現在、人工的なproteaseを組み込んだ受容体Aを作成し、もう１つそのproteaseの標的配列を組み込んだ受容体Bを作成することで、その２つの受容体が共に集積すると受容体Bが切れてしまうという系を立ち上げようとしています。 そこで、根本的な問題で心苦しいのですが、なにか良いproteaseはご存知ありませんか？ 現状、私の中では第一候補はよく研究の進んでいるcaspaseですがapoptosisの可能性など考えると最善ではないように思います。ひょっとすると合成生物学系では、このような場合に使用する標準的なproteaseがあるのでしょうか？

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---