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(無題) 削除/引用 No.5892-8 - 2017/04/14 (金) 19:24:21 - asan loxPの入った場所が悪くてCreなしでKOのような状態になってしまってるとかはないですか？ WTのマウスと比較してみるとかも必要かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.5892-7 - 2017/04/12 (水) 05:35:38 - おお in situ hybridizationは考えられたことはありますか。おそらく一考はしていると思われますが。

(無題) 削除/引用 No.5892-6 - 2017/04/11 (火) 04:20:42 - おお >組織中の標的細胞の割合は30%程度と言われております。 おそらくお察しだと思いますので書く必要もないかと思いますが、 たとえばターゲットの細胞とそうでない細胞で同様のレベルで発現していたとして３０％がターゲットの細胞ならqPCRで３０％の差が出るわけですよね。理論的には。でサイクル数にして０．５ぐらいの差になるわけで、、、きれいにそういうふうに差が出ても説得力あるかなぁというのと、もしかしたら統計的には差が示せないけど、KOのほうが低そうだなぁくらいのレベルでしかqPCRでは見れないのではと。

(無題) 削除/引用 No.5892-5 - 2017/04/10 (月) 23:44:50 - 研究者とは >AP様 返信ありがとうございます。 >qPCRのプローブ位置が、Creによる欠損後も保存される位置(exon1など)に設計されているというようなことはないでしょうか？ qPCRはSYBERグリーン法で行っております。 >あるいはexon5以降でも、短くなったmRNAが作られている可能性はないでしょうか？ このようなケースではタンパク質は発現しなくてもRNAレベルでは検出される、 というケースは考えられるかと思います。 Creによる欠損後もexon1とexon6は残存しているので、短くなったmRNAが作られている可能性はあると思います。 ただ、qPCRのプライマーがCreによって欠損する部分の配列を採用しているので、残存exonによる短いmRNAに対しては理論的にはPCRはかからないと思います。

(無題) 削除/引用 No.5892-4 - 2017/04/09 (日) 20:50:54 - AA qPCRのプローブ位置が、Creによる欠損後も保存される位置(exon1など)に設計されている というようなことはないでしょうか？ あるいはexon5以降でも、短くなったmRNAが作られている可能性はないでしょうか？ このようなケースではタンパク質は発現しなくてもRNAレベルでは検出される、 というケースは考えられるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5892-3 - 2017/04/09 (日) 02:55:42 - 研究者とは >おお様 早速の返信どうもありがとうございます。 >もともと標的になる細胞はその組織の中に何％ぐらいあるのでしょうかねぇ。。。１０％ぐらいだったら標的の細胞で完全にKOされていてもqPCRで差が出ないかもしれませんし。 組織中の標的細胞の割合は30%程度と言われております。 標的タンパク質が異なる組織特異的KOマウスでは、WBでもqPCRでも発現の低下が確認できます。ただ、標的細胞内の標的タンパク質の発現量が元々非常に低い可能性は否定できないですね・・ >また、両アレルとも潰れるようになってますか？ コンストラクト的には両方とも潰れることになってます。 >KOされることにより標的の細胞は増えなかったり、細胞死を起こして組織にあまり存在しないという可能性はどの程度ありますか？ この可能性については全く考えておりませんでした。細胞の恒常性維持に重要なタンパク質なので、あり得なくはないと思います。もしそういうことが起こっていれば必ず組織の機能に異常を来すはずなので、何匹かで機能解析してみようと思います。 >抗体はやはり必要だと思います。カスタムで作るのができないなら、抗体の会社によってはこの抗体ないよといえば製品化してくれるところもあるようです。ProteinTechとかだったかな、、、 標的タンパク質が膜タンパクでなかなかいい抗体がない・できないのが現状です。コマーシャルの物もいくつか試してみましたが、論文でworkしたことになっている抗体も過剰発現すら認識できない酷い抗体であったりしました。過去の論文で自作された物がいくつかあるので、今後それらのlabと連絡をとって譲ってもらう予定です。

(無題) 削除/引用 No.5892-2 - 2017/04/08 (土) 08:24:23 - おお もともと標的になる細胞はその組織の中に何％ぐらいあるのでしょうかねぇ。。。 １０％ぐらいだったら標的の細胞で完全にKOされていてもqPCRで差が出ないかもしれませんし。 また、両アレルとも潰れるようになってますか？ KOされることにより標的の細胞は増えなかったり、細胞死を起こして組織にあまり存在しないという可能性はどの程度ありますか？ 抗体はやはり必要だと思います。カスタムで作るのができないなら、抗体の会社によってはこの抗体ないよといえば製品化してくれるところもあるようです。ProteinTechとかだったかな、、、

組織特異的KOマウスのタンパク発現 削除/引用 No.5892-1 - 2017/04/08 (土) 05:16:12 - 研究者とは いつも勉強させてもらってます。 組織特異的KOマウスに関して皆様にご意見を伺いたいことがあり、投稿いたしました。 数年前にラボで作られた組織特異的KOマウスが、特に解析されることもなく細々と維持されていたのですが、この度ボスの命令で私が解析することとなりました。作った本人はもうラボにいないため、ノートなどの限られた情報を基にコンストラクトを確認したところ、 �@一般的なCre・loxpシステムで作られている �Aコンストラクトには問題なし(シークエンスで確認しました) �B6か所のエクソン(20kDa程度の小さなタンパクです)のうちCreによってエクソン2-5が除去される ことがわかりました。 本来であれば、WBで標的タンパク質の減少・消失を確認したかったのですが、困ったことに標的タンパク質に対する良い抗体が存在していないため、とりあえずqPCRでmRNA量をCre(+)・(-)で比較してみました。 エクソン2-5内の配列からプライマーを2種類準備して、Creの標的組織からRNA抽出・cDNA作製を行いました。ところが、結果はCre(+)・(-)で遺伝子発現量に違いはないというもので、2種類のプライマーともに同様の結果でした。 Creリコンビナーゼが作用していない可能性を考えて、標的組織から直接DNAを抽出し、エクソン2-5を挟む形でPCRをかけたところ、Creリコンビナーゼによってエクソン2-5が除去されていれば出現することが予想される短いproductがCre(+)のサンプルにだけ認められました。 これらの結果から、 �@コンストラクトおよびCreリコンビナーゼに問題なし �A標的組織内の標的細胞と異なる細胞が代償的に発現を増やしている と考えて、少し難しいのですが、今後は標的細胞のみを抽出してqPCRを再検しようと思っております。 以上のような経過なのですが、ラボ内にKOマウスに詳しい人がおらず、何かを見落としていないか大変気がかりです。 皆様からアドバイスやsuggestionをいただけますと幸いです。 よろしくお願いします。

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